1.2.3.1 Analyse de l’ADN mitochondrial

L’ADN mitochondrial (ADNmt) est un ADN extranucléaire circulaire de 16569 pb contenu au sein des mitochondries, organites cellulaires impliqués dans la respiration cellulaire. Il peut être séparé en deux régions distinctes : (i) une région non codante d’environ 1100 pb, appelée aussi région de contrôle et (ii) une région codante constituée de gènes codants principalement pour des ARN ribosomaux et de transfert ainsi que des protéines impliquées dans la phosphorylation oxydative (Figure 10).

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Figure 10 : Représentation schématique de l’ADN mitochondrial humain

Plusieurs caractéristiques font de cet ADN un support de choix pour les études d’ADN ancien.

L’ADNmt est présent en un nombre de copies élevé, il se transmet uniquement par voie maternelle via l’ovocyte, et passe de la mère à l’enfant sans recombinaison. Les variations de séquences apparues au niveau de la séquence d’ADNmt sont donc le fruit d’événements aléatoires qui apparaissent au cours du temps et qui sont transmis de la mère à l’enfant. Le taux de mutation n’est pas uniforme sur toute la séquence de l’ADNmt. La région non codante contient trois régions hypervariables appelées HV1, HV2 et HV3. Ce sont généralement ces régions, notamment les régions HV1 et HV2, qui sont classiquement analysées dans les études de génétique des populations puisque leur fort taux de mutations permettra d’observer des différences entre les populations.

L’ADNmt a été séquencé entièrement en 1981 (Anderson et al., 1981). Cette séquence appelée CRS (Cambridge Reference Sequence) a ainsi été utilisée comme séquence de référence. Une version corrigée (rCRS = revised Cambridge Reference Sequence) a été publiée quelques années plus tard (Andrews et al., 1999). Les études de comparaison se font donc par rapport à cette séquence de référence révisée. Récemment des auteurs ont proposé de remplacer cette séquence de référence par une séquence appelée « Reconstructed Sapiens Reference Sequence » (RSRS) située à la racine de l’arbre phylogénétique des Homo sapiens (Behar et al., 2012). En effet, les évènements mutationnels sont généralement reportés par rapport à la séquence rCRS or cette séquence est celle d’un européen moderne. La séquence RSRS correspondrait elle à une séquence ancestrale plutôt qu’à une séquence « périphérique » de la phylogénie. Cependant, l’ensemble des données disponibles que ce soit dans la littérature ou dans les bases de données telles que EMPOP (http://empop.org) sont annotées en fonction de la séquence rCRS. Afin de garder une cohérence et de faciliter les analyses, nous travaillerons donc toujours par comparaison avec la séquence rCRS.

Le séquençage de la région HV1 de l’ADN mitochondrial

Pour déterminer les haplotypes mitochondriaux de nos échantillons, nous avons séquencé une région de 381pb localisée sur la région hypervariable 1 (HV1) de l’ADN mitochondrial.

L’état généralement fragmenté de l’ADN étudié ne permet pas d’amplifier directement ce fragment en une seule fois, nous avons donc procédé au séquençage de deux fragments (HV1-A et HV1-B) chevauchants de 250 et 220 pb correspondant aux positions nucléotidiques 15989 à 16239 et 16190 à 16410. Le fait d’avoir des séquences chevauchantes permet

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également d’assurer un contrôle au niveau de la zone de chevauchement. Les amorces utilisées sont les suivantes :

HV1-A_F15989 : CCCAAAGCTAAGATTCTAAT HV1-A_R16239 : TGGCTTTGGAGTTGCAGTTG HV1-B_F16190 : CCCCATGCTTACAAGCAAGT HV1-B_R16410 : GAGGATGGTGGTCAAGGGAC

Les réactions d’amplifications ont été effectuées de manière indépendante dans un volume final de 50 µl contenant 10 µl d’extrait d’ADN, 1 µl de chaque amorce (10 µM), 10 µl de pré-mélange réactionnel 5X (5 µl de tampon HGS, 3 µl de MgCl2 25 mM, 0.5 µl de BSA 20 mg/ml, 0.1µl de chaque dNTP 100 mM, 1,1 µl d’eau ultra pure), 0.5 µl de HGS Diamond Taq® (Eurogentec) à 5 U.µl^-1et de l’eau ultrapure QSP 5 µl.

Les réactions d’amplifications ont ensuite été réalisées avec les paramètres suivants : une dénaturation initiale/activation à 94°C pendant 13 min, suivie de 38 cycles composés d’une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 sec, d’une étape d’hybridation à 48°C pendant 30 sec et d’une étape d’élongation à 72°C pendant 45 sec. La réaction est finalisée par une étape d’élongation à 72°C pendant 5min. Pour le fragment HV1-B le programme utilisé est le même à l’exception de la température d’hybridation qui est de 51°C.

Afin de vérifier la taille des produits amplifiés et d’estimer leur concentration, 10 µl de produits PCR ont été déposés sur gel d’agarose 2,5%. La concentration des produits d’amplification a été estimée par l’intermédiaire du marqueur de taille MassRuler^TM DNA Ladder, low range (Fermentas). Les produits PCR sont ensuite purifiés à l’aide du kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up, Macherey Nagel. Cette étape permet d’une part, d’éliminer les composants résiduels provenant du milieu réactionnel de la PCR autre que l’ADN (amorces, sels, dNTP), et d’autre part, de concentrer les produits PCR à la concentration requise (2 ng.µl^-1) pour la PCR de séquençage par ajustement du volume d’élution.

La PCR de séquençage est réalisée à l’aide du kit BigDye® Terminator V1.1 Cycle Sequencing (Life technologies). Le milieu réactionnel est composé de 2 µl de produits PCR purifiés et concentrés à 2 ng. µl^-1, 1 µl d’amorces à 0.8 µM, 1µl de mix 5X de 2 µl de BDT et d’eau ultrapure QSP 10 µl.

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Les produits sont ensuite purifiés par une précipitation à l’éthanol. Les 10 µl de la réaction de séquence sont déposés dans 40 µl d’une solution d’éthanol à 80% préalablement placée au congélateur pendant 2 heures minimum. L’ensemble est ensuite déposé à -20°C pendant 15 min. Puis les tubes sont centrifugés 30 min à 12000 g. Le surnageant est prélevé et le culot est rincé dans une solution d’éthanol à 70% puis agité légèrement et centrifugé 5 min à 12000 g.

Enfin, le surnageant est éliminé et le culot est laissé à l’air libre pendant plusieurs heures pour éliminer toutes traces d’éthanol qui pourraient entraver la lecture des séquences d’ADN.

Avant séquençage, le culot est resuspendu dans 10 µl d’eau ultrapure puis vortexé et centrifugé 15 min après.

Afin de réaliser l’électrophorèse capillaire 4 µl de chaque échantillon sont ajoutés à 16µl d’eau ultrapure. L’électrophorèse est réalisée sur un séquenceur automatique 3500 Genetic Analyser (Life technologies). Les séquences sont analysées grâce au logiciel Sequencher^TM 4.8 (Gene Codes Corporation). Une séquence consensus HV1 est construite pour chaque échantillon après un minimum de deux extractions et deux amplifications. Les haplotypes HV1 sont ensuite obtenus par comparaison à la séquence de référence rCRS. A partir de ces haplotypes, les haplogroupes sont déterminés à l’aide du logiciel haplogrep (http://haplogrep.uibk.ac.at/), des données de la littérature et du site phylotree reportant la phylogénie actuelle (http://www.phylotree.org/).

Typage des SNP de la région codante de l’ADN mitochondrial

Des positions polymorphes de la région codante de l’ADN mitochondrial ont été sélectionnées à partir du site « phylotree » et des données de la littérature afin de confirmer l’appartenance aux haplogroupes préalablement déduits du séquençage de la région HV1.

Au vu du nombre important d’haplotypes obtenus au sein parmi les échantillons anciens étudiés, nous avons choisi de typer uniquement les SNP spécifiques des macro-haplogroupes.

Les 13 SNP sélectionnés (Figure 11) ont été analysés dans une réaction multiplexe. Le typage a été réalisé par spectrométrie de masse MALDI-TOF dont le principe est présenté dans la section II.2.2.4. Les amorces utilisées ont été dessinées à l’aide du logiciel Assay Design 4.0 (Sequenom). Les amorces ainsi que la taille des amplicons attendus sont présentés en Annexe 1.

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Figure 11 : SNP de la région codante de l’ADN mitochondrial

Arbre phylogénétique représentant les 13 SNP de la région codante de l’ADN mitochondrial analysés en une seule réaction multiplexe par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les haplogroupes testés sont indiqués dans les ronds bleus. Les positions des SNP sur l’ADN mitochondrial ainsi que l’allèle muté par rapport à la séquence

de référence rCRS sont indiqués sur chaque branche.

II.1.2.3.2 Détermination des haplotypes et haplogroupes Y