Les prébiotiques

I.8.1. Notions de prébiotiques

Le terme de prébiotiques, introduit en 1995 par Gibson et Roberfroid, désigne des additifs ou des ingrédients alimentaires non digestibles qui affectent de façon bénéfique l’hôte en stimulant sélectivement la croissance et /ou l’activité d’une ou d’un nombre limité de bactéries du côlon, améliorant ainsi la santé de leur hôte (Ghosh, 2012;Nair et Soraisham 2013 ; Vieira et al., 2013 ). Le concept des prébiotiques n’été pas abondamment appliqué au vagin, mais vise essentiellement à stimuler la croissance de lactobacilles non pathogènes et des bifidobactéries (Li et al., 2012). Au niveau vaginal les prébiotiques sont principalement des composés oligosacharidiques (Sélectionnés en raison de leur structure chimiquement proche du glycogène) qui agissent comme substrats sélectifs, en favorisant considérablement la croissance des lactobacilles susceptibles de reconstituer un écosystème sain (Bohbot et Lepargneur, 2012).

I.8.2. Critères de sélection des prébiotiques

Afin de satisfaire la définition et la classification des prébiotiques, les molécules doivent pouvoir atteindre le côlon intactes où elles pourront alors être fermentées sélectivement dans l’écosystème intestinal complexe. Les candidats prébiotiques doivent être sélectionnés selon les différents critères suivants (Alloui et al., 2013) :

 Ne doit être ni hydrolysé, ni absorbé ;

 Stimuler sélectivement la croissance d'une ou d’un nombre limité des bactéries potentiellement bénéfiques ;

 Altérer positivement la composition ainsi que les activités de la microflore gastro-intestinale

 Induction éventuelle d’effets systémiques qui peuvent être positifs pour la santé de l’hôte. I.9. Notion des symbiotiques

L'association entre un probiotique et un prébiotique, s'appelle un symbiotique. Ce terme désigne tout aliment ayant à la fois un effet pré- et probiotique. Un aliment symbiotique agit par l’action du prébiotique qui va favoriser le développement du probiotique et potentialiser ainsi l’effet bénéfique de ce dernier sur la santé (Suskovic et al., 2001 ; Schrezenmeir et De Vrese, 2001 ; Shah, 2007). L’effet symbiotique n’est pas requis, mais il est possible que le prébiotique soit ajouté afin de favoriser la survie et l’activité des souches probiotiques. Si une telle relation est indiquée, elle doit être scientifiquement démontrée (Merrifield et al., 2010).

L’ensemble de notre travail a été réalisé au laboratoire de microbiologie de la faculté des sciences de la nature et de la vie de l’Université de Jijel, au laboratoire de recherche de pharmacologie et phytochimie ainsi qu’au niveau du Centre Wallon de Bio-Industries, Gembloux Agro-Biotech - Université de Liège/Belgique, durant la période Avril 2012 à juillet 2015.

II.1. Matériel

II.1.1. Les souches bactériennes

Des souches ayant comme origine les infections urogénitales et des souches ATCC ont été utilisées, elles sont les suivantes:

 E. coli, Staphylococcus aureus et Candida albicans, d’origine vaginale. Elles ont été isolées

à partir des échantillons cliniques fournis par le laboratoire d'analyse médicale du D^r. Bekioua Abdelaaziz de Jijel, Algérie ;

 E.coli et Kebsiella. ssp, d’origine urinaire. Elles ont été isolées à partir des échantillons

cliniques et fournis par le laboratoire d'analyse médicale du D^r. Bekioua Abdelaazize de Jijel, Algérie ;

 Les souches de référence ATCC : E.coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC25923,

Klebsiella pneumonia ATCC700603 ont été fournies par le Centre Hospitalo-universitaire de

Constantine (Algérie).

II.1.2. Les cellules épithéliales vaginales

Notre étude a été menée sur la cavité vaginale des femmes apparemment saines. A partir de 80 femmes, d’âge compris entre 25 et 41 ans, une série d’échantillons de cellules épithéliales a été prélevée de la cavité vaginale par les sages femmes des Etablissements Populaires et Santé Publique de Jijel (la polyclinique Alia Mohammed et la polyclinique Tebal Abdel-Madjid). Les candidates volontaires n’ont eu aucun traitement antimicrobien au cours des deux semaines qui précède l’échantillonnage, elles n’ont pas d'antécédents d'infections urinaires récurrentes, pas d'utilisation de contraceptifs oraux et pas d'utilisation de spermicides.

II.1. 3. Le sang

Les échantillons du sang humain ont été obtenus à partir de la Banque de sang de l’hôpital Mohamed Seddik Ben Yahia, Jijel des trois groupages A, B et O. Des échantillons de sang de rats ont été obtenus à partir des animaux de l’animalerie de la faculté des sciences de la nature et de la vie de l’université de Jijel.

II.1.4. Les disques antibiotiques

Les antibiotiques utilisés au cours de notre étude sont les inhibiteurs de la synthèse de la paroi cellulaire représentés par l'ampicilline (10 mcg), la céfotaxime (30 μg), les inhibiteurs de la

Chloramphénicol (30 μg) et la Tétracycline (30 μg) et les inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques, représentés par l’Ofloxacine, (5 μg), le Triméthoprim-sulfaméthoxazole (25 μg), la Ciprofloxacine (5 μg) et le Nitrofurantoïne (200 μg). Les disques d'antibiotiques ont été obtenus auprès du laboratoire d'analyses médicales Bourouied portant le label Bioanalyse®.

ABORATOIRE D'ANALYSES MEDICAL

II.1.5. Les milieux de culture et les sucres

Plusieurs milieux de culture et des sucres ont été utilisés au cours de cette étude expérimentale, il s’agit de ce qui suit:

 Les géloses : MRS (de Man-Rogosa et Sharp), Mueller-Hinton, hypersaccharosée, gélose au

sang de cheval, gélose nutritive, Chapman et Sabouraud ;

 Les bouillons : MRS, Môeller à arginine, nutritif et hypersaccharosé ;

 Autres milieux: Milieu Gibson-AbdelMalek, milieu MEVAG sans sucre ;

 Les sucres : Amidon 10%, Arabinose 20% , Cellubiose 10%, Dextrine 6%, Dulcitol 6%, Galactose 20%, Glucose 20%, Glycérol, Inositol 6%, Levulose 20%, Maltose, Mannose 20%, Méthyle de mannose, Raffinose 20%, Salicine 6%, Sorbitol 20%, Sorbose 20%, Trehalose 6% et Xylose 20%.

II.1.6. Les enzymes

Lors de la réalisation de cette étude, nous avons utilisé les enzymes suivants :

 Trypsine (Fluka- Biochemika) ;

 Pepsine (SIGMA life science) ;

 Lipase (Fluka, Lipase from hog pancreas);

 Peroxydase (Sigma-Aldrich, USA) ;

 Pancréatine (Swiss Herbal Remedies )

II.2. Méthodes

II.2.1. Sélection de lactobacilles vaginaux à fort potentiel probiotique II.2.1.1. Score de Nugent

Un total de 60 femmes de la région de Jijel (Algérie) ont été incluses dans cette étude lors de leur visite prénatale de routine à la polyclinique Alia Mohammed et à la polyclinique Tebal Abdel-Madjid, Jijel, de mai 2012 à septembre 2013. Des échantillons vaginaux ont été obtenus chez des femmes menstruées dont l’âge est entre 19 et 46 ans avec un écosystème vaginal sain. Les échantillons ont été obtenus de tous les volontaires après une information verbale. Tous étaient pré-ménopausées, non enceintes, ne prenaient pas de hormones stéroïdiennes, ni d’antibiotiques et aucune infection n’est visible pendant l’examen par speculum.

A partir du liquide vaginal, deux prélèvements pour chaque femme ont été recueillis avec des écouvillons stériles insérés dans le vagin, mis en rotation quelques tours le long de la paroi vaginale

et laissés absorber pendant quelques secondes (Fraga et al., 2008). Les écouvillons ont été par la suite immergés dans une solution saline stérile, le premier écouvillon servira pour préparer un frottis qui subira une coloration de Gram pour évaluer l’absence d’infection en utilisant les critères de Nugent, la flore a été interprétée comme score normale (0-3), comme intermédiaire (4-6) et interprétée comme compatible avec VB (7-10), alors que le deuxième écouvillon a été utilisé pour l’isolement des souches lactiques (Ayenalem et al., 2010).

Pour chaque morphotype, nous avons établi un score (0 à 4), par le calcul du nombre de bactéries par champ selon les données du tableau 7.

Tableau 7. Score de Nugent (0 à 10) par coloration de Gram des Frottis vaginaux Morphotypes

(Immersion objectif 100)

Quantité / Champ

> 30 6 à 30 1 à 5 < 1 0

Morphotype Lactobacilles (L) 0 1 2 3 4 Morphotype Gardnerella vaginalis (G) 4 3 2 1 0 Morphotype Mobiluncus. spp (M) 2 2 1 1 0

L’addition des 3 scores correspond au score de Nugent

Les 3 morphotypes qui entrent dans l’établissement du score L G M sont (Nugent et al., 1991) : (L) : Le morphotype lactobacilles : bactéries à Gram positif, à bords parallèles, le plus souvent droits, de longueur et d’épaisseur variables ;

(G) : Le morphotype Gardnerella vaginalis: nombreux bacilles ou coccobacilles à Gram positif et/ou négatif correspondant à la prolifération poly microbienne des bactéries, souvent d’aspect corynéforme, en générale de petite taille ;

(M) : Le morphotype Mobiluncus. spp : bacilles incurvés à Gram variable dont l’aspect évoque un coup d’ongle.

II.2.1.2. Mise en place d’un souchier de lactobacilles lactiques à partir des prélèvements vaginaux

Les lactobacilles vaginaux ont été isolés sur gélose MRS qui est leur milieu sélectif. La méthode décrite par Reid (2000) et Ayenalem et al.(2010) a été utilisée avec des modifications mineures. Les écouvillons ont été vortexés pendant 1 minute à vitesse maximale pour suspendre les bactéries attachées. Des séries de dilutions décimales ont été préparées à partir de l’échantillon. 1ml de cette solution mère a été transféré dans 9 ml d’eau physiologique ; c’est la dilution 10^-1. De la même

dernière dilution ont été ensemencés sur la gélose MRS pH 5,5 à raison de 2 boites par dilution. Les boites de Pétri ont été incubées en anaérobiose à 37°C pendant 24 à 48h. Les lactobacilles sont généralement des microaérophiles, leur incubation en anaérobiose a été assurée par la mise des boites de Pétri dans des sachets de Gaz pâque (BD Gaspak^TM Anaerobic system, USA).

 Purification des isolats lactiques

Afin de purifier les isolats, des repiquages successifs ont été réalisés sur gélose et bouillon MRS. Le prélèvement et la remise en suspension ont été réalisés, uniquement, pour des colonies bien distinctes, homogènes et bien développées. La pureté de la souche a été vérifiée par examen macroscopique et microscopique (Idoui et al., 2009). Les isolats ainsi purifiés ont été conservés à – 20°C sur bouillon MRS additionné de glycérol stérile (40% : v/v).

II.2.1.3. Screening de souches productrices d’eau oxygénée

Soixante-dix isolats de lactobacilles ont été testés pour la production d’H2O2 par l’application de la méthode décrite par Pascual et al. (2006) et Yixu et al. (2008).

Les isolats ont été cultivés sur la gélose MRS additionnée de 250 mg / mL de 3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidine et 0,01 mg / ml de peroxydase de Raifort, puis les boites ont été incubées en anaérobiose à 37ºC pendant 48h. Les boites sont laissées ouvertes pendant 30 min sous la hotte. Après cette exposition à l’oxygène, les colonies produisant du peroxyde d’hydrogène se colorent en bleu.

La peroxydase du milieu réagit avec le peroxyde d’hydrogène produit par les lactobacilles pour libérer de l’oxygène et des protons qui vont réduire la tétraméthylbenzidine en formant ainsi un produit coloré. La production de peroxyde d’hydrogène est évaluée selon l’intensité de la coloration : (+++) forte production, (++) production moyenne, (+) faible production, (-) sans production

II.2.1.4. Pré-identification des souches sélectionnées

L’identification des isolats a été réalisée par l’application des techniques de microbiologie classique, basées sur la recherche d’un certain nombre de caractères morphologique, physiologique et biochimique. Les principaux tests utilisés pour l’identification des Lactobacillus sont les suivants (Vasquez et al., 2002 ; Idoui et Karam, 2008) :

 Examen microscopique : Après l’examen macroscopique des colonies sur gélose MRS, et

dans le but d’écarter tous ce qui ne peut être une bactérie lactique, les isolats ont été soumis à l’examen microscopique qui est révélé par la coloration de Gram (annexe). Celle-ci permet de faire la différentiation entre les bactéries Gram positives et Gram négatives et renseigne sur la forme et le mode de regroupement.

 Etude des caractères biochimiques : Les caractères biochimiques sont les suivants :

a. Recherche de la catalase : Pour réaliser ce test, nous avons émulsionné la culture bactérienne (ose de colonie) à tester dans l’eau oxygénée à 10 volumes, sur une lame stérile. La présence d’une catalase, se manifeste par l’apparition de bulles d’airs abondantes dans l’émulsion, ce qui traduit la décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de la catalase. Toutes les souches purifiées ont été soumises à ce test.

b. Recherche de citratase : Cette enzyme est mise en évidence par culture sur gélose

MRS additionnée de 6g de citrate d’ammonium, l’ensemencement se fait par piqure centrale de la gélose préparée en tube, suivi d’une incubation à 37°C/3 à 5 jours.

La décomposition du citrate se manifeste par la production du gaz au fond des tubes, donc c’est la première réaction de transformation du citrate en diacétyle et acétoine.

c. Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) : Pour réaliser ce test, nous avons ensemencé le bouillon Moeller à l’arginine avec les souches à tester, suivi d’une incubation à 37°C /24h.

La culture sur le milieu de base se manifeste par virage du milieu au jaune dû au métabolisme du glucose. Par contre la dégradation de l’arginine et la libération d’ammoniac empêche le virage au jaune.

d. Profil fermentaire des sucres : Les lactobacilles sont connues pour leur capacité de fermenter les glucides. Ce test a été réalisé sur milieu MEVAG (milieu d’étude de la vois d’attaque des glucides) dans une microplaque stérile. Pour effectuer ce test, les sucres à tester ont été ajoutés au milieu MEVAG fondu et refroidi à 37°C, les souches bactériennes ont été ensemencées et pour favoriser l’anaérobiose, de l’huile de vaseline a été ajoutée. Après 24h d’incubation, le développement de la culture et le virage de l’indicateur coloré due à l’acidification du milieu traduit l’utilisation du sucre.

e. Recherche de type fermentaire : Pour mettre en évidence le type métabolique, nous

avons réalisé deux tests à là fois : Le premier test est d’ensemencer des tubes contenant le bouillon MRS munis de cloches du Durham par les souches à tester suivi d’une incubation à 37°C/24h. Le deuxième test, consiste en la préparation du milieu de Gibson Abdel Malek préalablement fondu, refroidi et solidifié en position verticale puis ensemencer par les souches à tester. Un bouchon de gélose blanche stérile a été coulé en surface.

Après une incubation à 37°C/3 à 7 jours, le développement d’une bactérie homofermentaire ne provoque pas de discontinuité entre le milieu et le bouchon de gélose, par contre un métabolisme hétéro fermentaire se traduit par un décalage du bouchon de gélose vers le haut

II.2.2. Évaluation des aptitudes probiotiques in vitro de souches sélectionnées II.2.2.1. Tolérance aux conditions acides et aux sels biliaires

Quatorze (14) isolats de lactobacilles ont été sélectionnés sur la base de la production d’H₂O₂. La tolérance aux acides à pH 2,0 et la capacité des souches à croître en présence de 0,3℅ de sels biliaires, (p / v) ont été déterminées selon la méthode décrite par Kaewnopparat et al. (2013) avec une légère modification. Les isolats ont été cultivés sur bouillon MRS pendant 16-18 heures et les cellules ont été recueillies par centrifugation (30 000 x g, 15 min). Chaque culot a été lavé deux fois, puis mis en suspension dans du tampon phosphate salin (PBS, pH 7). Environ 10⁸ UFC / ml de chaque isolât a été inoculé dans le PBS acidifié (pH 2) et incubé pendant 2 h. Les cellules viables ont été comptées à 0 h et après 2 h d’incubation. La tolérance biliaire de chaque isolât a été déterminée en comparant le compte des cellules viables après 8 h d'exposition au sel biliaire avec le comptage initial à 0 h.

II.2.2.2. Tolérance aux enzymes pancréatiques par la simulation des conditions du fluide intestinale (FIS)

La technique de Woraharn et al. (2010) a été utilisée pour étudier la capacité des bactéries lactiques à survivre dans des conditions similaires au fluide intestinale humain. Pour cela, un fluide intestinal simulé (FIS) a été préparé dont la composition est la suivante : 9g / L de NaCl, 10 g / L de pancreatine, 10 g / L de trypsine et 3 g / L de sels biliaires, le pH a été ajusté à 6,5. Les cultures ont été incubées dans cette solution pendant 180 min à 37 °C. Le nombre de cellules viables a été compté à 0 h, 90 min et après 180 min.

II.2.2.3. Adhésion aux cellules épithéliales vaginales

Pour étudier la capacité des BL vaginales à adhérer aux cellules épithéliales vaginales, nous avons combiné entre les méthodes décrites par Mclean et Rosenstenin (2000), Otero et Nader-Macias (2007) et Fraga et al. (2008). Le test d’adhésion a été réalisé en trois étapes :

 Préparation des cellules épithéliales vaginales (CEV) : Les CEV ont été recueillies par écouvillonnage de la paroi vaginale des femmes volontaires en bonne santé préménopausées puis sont transférées dans le tampon acide citrique-Na2HPO4 pH4.5, 0.04 M. et stockées à 4 ° C pendant au moins 3h jusqu'à leur utilisation. Les cellules ainsi obtenue ont été soumises à 10 lavages par le même tampon (800xg pendant 7min) pour l’élimination de tout leur contenu bactérien; elles ont été ensuite placées dans un bain du même tampon avec une concentration de 1 x 10⁶ CEV / ml.

 Préparation des cellules bactériennes : Des cultures jeunes de bactéries lactiques ont été centrifugées à 6000xg pendant 15 min, le culot de chaque culture a été récupéré, puis soumis

à un lavage par le PBS pH7. Une autre centrifugation à 6000xg pendant 10 min a été réalisée et le culot bactérien a été suspendu dans le même tampon. À partir de la suspension obtenue, nous avons standardisé chaque culture par la mesure de son absorbance à DO_600. À partir de chaque suspension standardisée, des dilutions décimales V/9V ont été réalisées jusqu'à l’obtention de la dilution 10-8

. Cette dilution a servi pour le dénombrement sur gélose MRS.

 Adhésion : 1ml de chaque suspension bactérienne (tampon PBS) a été mélangé avec 1ml de

la suspension des cellules épithéliales. Une incubation avec une douce agitation a été faite à 37^°C pendant une heure.

Les cellules avec des bactéries adhérentes ont été recueillies et lavées trois fois dans le tampon Na2H2OP4- acide citrique (800 x g, 7min) pour éliminer les bactéries non attachées.

 Observation microscopique : L'adhérence bactérienne aux CEVs a été évaluée par

microscopie (x 100) après coloration avec le cristal violet à1℅. Le nombre de bactéries attachées à 50 CEVs à des frottis consécutifs a été compté. En plus, des frottis de CEVs ont été effectués comme contrôle pour confirmer que la présence de bactéries indigènes était nulle ou négligeable. Le nombre retenu est la moyenne de nombre de bactéries attachées aux cellules épithéliales.

II.2.2.4. Activité antibactérienne et effet des surnageants

Ce test consiste à étudier l'activité inhibitrice des lactobacilles vaginaux vis-à-vis des souches pathogènes vaginale, urogénitale et indicatrices.

L'activité antibactérienne a été évaluée par la méthode des disques avec des modifications mineures (Aroutcheva et al., 2001 ; Voravuthikunchai et al., 2006) : elle consiste a étaler la suspension standardisée de chaque microorganisme pathogène (10⁷ UFC / mL) sur la surface du milieu Mueller-Hinton. Après incubation pendant 30 min à 37°C, des disques stériles (de 5 mm de diamètre) ont été déposés à la surface de la gélose. Par ailleurs, les isolats de lactobacilles ont été cultivés sur bouillon MRS et incubés à 37 °C pendant 18 h. Les surnageants de culture ont été filtrés à travers un filtre de cellulose de 0,22μm (Sartorius, Allemagne). Des aliquotes standardisés (25 μl) de cultures et des surnageants de lactobacilles ont été déposées sur les disques dans les boites déjà inoculées par les souches pathogènes, puis incubées pendant 24 h à 37 °C. Le diamètre des zones d'inhibition a été mesuré. Des essais de contrôle du milieu MRS avec pH 6,5 et pH 4,0 ont été également effectués.

II.2.2.5. Capacité à l’auto-agrégation et à la co- agrégation

Les essais d'auto-agrégation et de la co- agrégation ont été effectués selon la méthode décrite par

Kos et al. (2003). Les cellules bactériennes de culture d'une nuit ont été récoltées par centrifugation

à 5000 x g pendant 15 min, suivi d’un double lavage avec 2 ml du tampon PBS, puis les cellules sont resuspendus dans le même tampon pour avoir approximativement un nombre de 10⁸ UFC/mL. La suspension des cellules standardisée (4 ml) a été mixée par vortex pendant 10 secondes et l’auto- agrégation a été déterminée durant cinq heures d’incubation à la température ambiante. Chaque heure, 0.1 ml de la suspension déjà préparée a été transféré aseptiquement dans un autre tube contenant 3.9 ml de tampon PBS et la DO (A) a été déterminée à 600 nm.

Le test est dit positif s’il y à apparition d’un précipité au fond du tube, lié à une agrégation cellulaire. Le pourcentage d’auto-agrégation est calculé en appliquant la formule suivante :

Où :

A_t : Représente la DO pendant le temps t = 1, 2, 3, 4 et 5 heure. A₀ : Représente la DO à t = 0 heure

Collado et al. (2008) et Gilet al. (2010), ont montré la capacité des lactobacilles vaginaux à se co-agréger avec C. albicans, E. coli et S. aureus, empêchant ainsi leur expansion. La méthode appliquée par les auteurs cités-dessus a été utilisée pour tester l’aptitude de nos lactobacilles à co-agréger certaines souches pathogènes.

La méthode de la préparation des suspensions cellulaires pour la co- agrégation est la même que celle du test d’auto- agrégation. Le même volume (2 ml) de chaque suspension cellulaire a été mixé en double avec 2 ml de la suspension bactérienne à savoir E.coli et Staphylococcus aureus puis vortex pendant 10 secondes. La DO à 600 nm de la suspension mixte a été mesurée à temps 0 heure et après 5 heures d’incubation à la température ambiante. Le pourcentage de la Co-agrégation est calculé selon la formule suivante :

[(Ax + Ay)/ 2)]  A(x+y) Ax + Ay/ 2

Où :

A_x : Représente la DO de la suspension cellulaire des lactobacilles ; A_y : Représente la DO de la suspension cellulaire des souches tests ;

A(x+y) : Représente la DO de la mixture entre la suspension cellulaire des lactobacilles et de la suspension cellulaire des souches tests.

% d’auto-agrégation = [1 – (At / A0) × 100]

x 100 ℅ Co-agrégation =

II.2.2.6. Test d’hydrophobicité

L’hydrophobicité est déterminée selon la méthode décrite par Iyer et al.(2010) : Le culot bactérien a été récupéré par centrifugation à froid à 12 000 trs / 15min suivie de deux lavages successifs dans 1.2 ml de tampon urée phosphate magnésium. La densité optique initiale (DO _initiale) de la suspension, lue à 450 nm a été ajustée approximativement à 1. Ensuite 0.6 ml du xylène a été ajouté doucement à 3 ml de la suspension bactérienne puis incubée à 37°C pendant 10 min. Ce mélange a été agité pendant deux minutes. Après 15 min, la phase aqueuse a été récupérée à l’aide d’une