- un individu est du groupe O s’il ne possède aucun Ag et possède les Ac anti A et
III- ETUDE PRATIQUE
1- Population cible
6-3- Surveillance
La surveillance du transplanté est importante afin d’éviter tout risque de rejet, celle-ci est basée sur un suivi clinique, biologique, radiologique et histologique.
Le suivi clinique comprend la surveillance de la diurèse, du poids, de la tension artérielle et de la température. Quand au suivi biologique, il permet de mesurer les taux de créatinine, d’urée, la protéinurie, ainsi que d’établir un ionogramme. Ce suivi englobe aussi le dosage des IS et les recherches de virus et bactéries, et celles des Ac anti HLA.
Enfin, pour ce qui est du suivi histologique, c’est une biopsie du greffon, qui est le seul moyen de prouver le rejet et d’en évaluer la sévérité. [9]
III- ETUDE PRATIQUE
Ce travail est une étude rétrospective sur une période de 15 ans entre 2000 et 2015, concernant 237 patients greffés rénaux suivis immunologiquement au laboratoire d’histocompatibilité du CHIS.
1- Population cible
1-1- Receveurs
Cette étude s’intéresse à des patients insuffisants rénaux chroniques ayant bénéficiés d’une transplantation rénale dans différents centres hospitaliers universitaires (CHU Rabat, Casablanca, Fès et Marrakech), l’HMIMV ou l’hôpital CZ. Ces patients ont été adressés au laboratoire d’histocompatibilité du CHIS pour une prise en charge immunologique.
237 patients greffés ont bénéficiés d’un suivi immunologique soit pré et post greffe, soit uniquement pré greffe ou uniquement post greffe.
Chaque patient s’est présenté au laboratoire avec une fiche de renseignements précisant la structure sanitaire et le service demandeur, les données démographiques (identité, âge, sexe), biologiques (groupage ABO) et cliniques du patient (antécédents personnels et familiaux, antécédents d’immunisation: transfusion, grossesse, transplantation ou détransplantation). Le laboratoire attribu à chacun un numéro d’identification de RER unique afin de constituer un dossier comprenant toutes les informations concernant le receveur et le ou les donneurs éventuels de rein (DER). En plus du format papier, l’équipe du laboratoire renseigne un fichier Excel avec les mêmes données. Enfin, depuis 2014 toutes les informations sont enregistrées dans un logiciel de gestion des laboratoires du CHIS (appelé e-labs LIMS).
Suivi d’une cohorte de greffés rénaux au laboratoire d’histocompatibilité du centre hospitalier Ibn Sina
1-2- Donneurs
237 donneurs, dont 182 sont des donneurs vivants apparentés (ascendants, descendants, conjoints, oncles, tantes, cousins, frères et sœurs), 22 sont des donneurs en EME et 33 non renseignés.
L’appariement receveur-donneur se fait selon l’origine du greffon: lorsque la greffe se fait à partir d’un donneur vivant, celui ci est choisi parmi tous les donneurs possibles. Par contre dans le cas d’un donneur en EME, c’est le receveur qui est choisi parmi les receveurs inscrits sur la liste d’attente locale puis nationale.
Les donneurs vivants sont déclarés aptes au don lorsqu’ils ne présentent aucune contre indication transitoire ou définitive. Le donneur doit avoir un bon état général, une fonction rénale normale, une anatomie de l’appareil urinaire normale et qui permet le prélèvement. Il doit être compatible avec le receveur dans le système ABO. Par ailleurs, le donneur vivant doit avoir donné son consentement éclairé au tribunal. Pour le donneur en EME, s’il n’a pas manifesté d’opposition au don lors de son vivant, l’accord de la famille est demandé.
2- Méthodologie
2-1- Description des différentes analyses réalisées au laboratoire d’histocompatibilité
Le laboratoire d’histocompatibilité du CHIS réalise plusieurs analyses en pré greffe et en post greffe. Les analyses immunologique pré greffe ont pour objectif la détermination du meilleur donneur vivant pour un receveur ou le meilleur receveur pour le donneur en EME. Ceci afin d’éviter les rejets immunologiques.
Il y a 3 étapes dans le suivi immunologique pré-greffe des patients:
- Etape 1: le receveur: groupage érythrocytaire ABO, typage HLA Cl I (A et B) et Cl II (DR et DQ), recherche d’Ac anti HLA tous les 3 mois et à J15 et J30 après chaque événement immunisant. Ces sérums sont ensuite conservés en sérothèque. En cas de recherche positive, une identification est réalisée.
- Etape 2: le donneur: groupage érythrocytaire ABO, typage HLA Cl I (A et B) et Cl II (DR et DQ).
- Etape 3: donneur et receveur: Cross match lymphocytaire.
2-1-1-Groupage érythrocytaire ABO
Cette analyse se fait sur 2 prélèvements différents, à 2 moments différents avec deux techniques d’agglutination différentes.
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Le donneur de groupe O est un donneur universel, il peut donner à tous les patients des autres groupes contrairement au donneur AB qui ne peut donner qu’à un receveur AB. Le donneur de groupe A peut donner aux receveurs de groupe AB et A et enfin le donneur de groupe B peut donner aux receveurs de groupe AB et B. (Figure 1)
2-1-2- Typage HLA
Le typage HLA consiste à mettre en évidence les gènes du CMH qui se sont exprimés chez l’individu (typage par biologie moléculaire). Il est également possible de mettre en évidence les protéines HLA codées par ces gènes à la surface des lymphocytes T et B (typage par sérologie).
Le laboratoire d’immunologie du CHIS, adopte la stratégie suivante:
- Le typage Cl I se fait en technique sérologique basée sur une réaction de micro-lymphocytotoxicité dépendante du complément (LCT). En cas d’ambiguïté, les techniques de biologie moléculaire (BM) sont utilisées: PCR-SSP («Polymerase Chain Reaction-Specific Sequence Primer») ou PCR-SSO Luminex («PCR-Specific Sequence Oligonucleotide»).
- Le typage Cl II, est réalisé par BM PCR-SSP et peut être confirmé par la technique PCR-SSO. Ces techniques de BM utilisent un kit commercial spécifique (One Lambda).
2-1-2-1-Typage par technique sérologique
Pour identifier les molécules HLA Cl I, le choix s’est porté sur les lymphocytes T qui les expriment fortement. Pour cela, les lymphocytes T sont isolés à partir d’un échantillon sanguin prélevé sur un anticoagulant (héparinate de lithium). Cet isolement se fait grâce à des billes magnétiques recouvertes d’un anticorps monoclonal CD2. Tous les lymphocytes T portent la molécule CD2 et se fixent alors à ces billes. Ces lymphocytes sont ensuite répartis dans des plaques de Terasaki dont les puits sont cotés par des Ac anti HLA et où le complément est déjà distribué. Ainsi, si ces lymphocytes présentent l’Ag correspondant à un Ac, le complexe Ag-Ac se forme,
A
B
O AB
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active le complément et l’ensemble provoque une lyse cellulaire qui est visualisée après l’ajout d’un colorant fluorescent en fin de réaction.
La lecture se fait à l’aide d’un microscope inversé à fluorescence, permettant d’évaluer le pourcentage de cellules vivantes par rapport aux cellules mortes, respectivement colorées en vert et rouge.
2-1-2-2-Typage par technique de biologie moléculaire
Les techniques de BM utilisent l’ADN comme base de travail. L’ADN est extrait du «buffy coat» à l’aide du kit commercial «Quiagen» conformément aux instructions du fabricant.
Ce «buffy coat» est une couche riche en lymphocytes, obtenue après centrifugation des échantillons sanguins prélevés sur EDTA.
L’ADN obtenu est alors amplifié par la réaction PCR («Polymerase Chain Reaction») afin de synthétiser un brin d’ADN complémentaire.
Pour l’amplification, le laboratoire utilise des plaques «MicroSSP», où est distribué le mélange ADN extrait, amorces, dNTP (ATP, TTP, GTP, CTP), ions MgCl2 et ADN polymérase thermostable (Taq polymérase). Cette plaque est alors déposée dans un thermocycleur pour que l’ADN subisse plusieurs cycles d’amplification.
℘ PCR-SSP: comme le nom l’indique, l’amplification se fait par des amorces spécifiques des allèles à amplifier. Ces derniers, suite à leur amplification, sont déposés dans un gel d’agarose à 2,5% contenant un agent intercalant, le bromure d’éthydium pour leur migration en électrophorèse. Le gel est ensuite mis sur une table à lumière ultra violet (UV) afin de procéder à la lecture des bandes d’ADN. Enfin les bandes correspondant à une amplification spécifique sont relevées et analysées à l’aide du logiciel d’interprétation fournit par le fabriquant.
℘ PCR-SSO Luminex: l’amplification se fait par des amorces choisies dans des séquences conservées, encadrant les régions polymorphes. Suite à leur amplification, ils sont déposés sur un support solide et hybridés avec des sondes oligonucléotidiques marquées détectant les différentes séquences entre allèles ou groupes d’allèles. En effet, au laboratoire, cette technique, utilise ces sondes oligonucléotidiques spécifiques du système HLA fixées sur des billes de polystyrène, ayant chacune une caractéristique de fluorescence. Les réactions sont finalement analysées par un cytomètre en flux (Luminex LABScan 200TM flow analyzer).
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2-1-3-Recherche des anticorps anti HLA
Dès qu’un patient insuffisant rénal est inscrit dans un programme de greffe, des recherches d’Ac anti HLA sont réalisées de façon régulière. Les recommandations internationales préconisent une recherche tous les 3 mois et à J15 et J30 après chaque événement immunisant (transfusion, grossesse, transplantation). Les sérums sur lesquels une recherche a été réalisée sont aliquotés et stockés en sérothèque à -20°C pour être utilisés lors du cross match.
La recherche des Ac anti HLA peut être réalisée par une technique ELISA “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” ou par une technologie «Luminex».
Au laboratoire du CHIS, jusqu’en 2010 la recherche d’Ac fut effectuée par la technique ELISA et de 2010 à aujourd’hui cette recherche est exclusivement réalisée en Luminex. [10]
2-1-3-1- ELISA “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”
C’est une technique en phase solide, se basant sur une méthode immuno-enzymatique indirecte, détectant uniquement les Ac de classe IgG.
Les sérums à tester sont déposés dans les puits des microplaques contenant des Ag HLA purifiés et de spécificités connues. Si le sérum du receveur contient un Ac anti HLA, celui-ci se lie à l’Ag correspondant. Ce complexe immun est mis en évidence par l’ajout d’un Ac anti Ig humaine couplé à une enzyme. L’ajout du substrat de l’enzyme permet une lecture colorimétrique au spectromètre.
2-1-3-2- Luminex («Labscreen mixte», One lambda)
C’est également une technique en phase solide, ayant plus ou moins le même concept que la technique ELISA. Le support solide utilisé ici est un panel de billes recouvertes d’Ag HLA purifiés. Les Ac éventuels des sérums à tester se fixent sur les billes qui portent les Ag HLA correspondants. La réaction est révélée par un Ac de chèvre anti-IgG humaine conjugué à la phycoérythrine. La fluorescence est mesurée à l’aide d’un analyseur de flux «Luminex» qui est un cytomètre à deux lasers. (Figure 2)
Le résultat de cette recherche est exprimé en terme de négatif (pas d’Ac anti HLA) ou positif (Ac anti HLA présents). Dans le cas où cette recherche est positive, l’identification de l’Ac ou des Ac présents chez le receveur est indiquée.
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Figure 2: Technologie luminex.
2-1-4- Identification des anticorps anti HLA
Cette analyse est réalisée suite à une recherche d’Ac anti HLA positive. Elle permet d’identifier la spécificité des Ac. Les spécificités HLA identifiées seront confrontées au moment de la greffe avec les Ag HLA du donneur. S’il y a correspondance, ces Ac sont nommés DSA, Ac dirigé contre les cellules du donneur. Les techniques d’identification sont les mêmes que celles de la recherche d’Ac. La différence est que les puits des microplaques pour l’ELISA et les billes pour le Luminex ne portent qu’une seule spécificité HLA.
L’identification en SA (Single Antigen) permet de déterminer le taux d’Ac. Ce taux est exprimé en MFI: Mean Fluoresecence intensity = fluorescence moyenne de l’Ac. Si la MFI est inférieure à 1000, le test est considéré comme négatif. Si la valeur est supérieure à 2000, le test est positif. Les valeurs entre 1000 et 2000 sont considérées comme intermédiaires.
2-1-5- Cross Match lymphocytaire
C’est la dernière analyse réalisée avant la greffe. C’est une réaction entre les sérums du patient et les lymphocytes du donneur pour mettre en évidence la présence d’un éventuel DSA.
Le cross match est réalisé sur au moins 2 sérums à 10 jours d’intervalle, lorsque la greffe est urgente. En dehors de l’urgence, les sérums du receveur (sérothèque) à tester en cross match sont sélectionnés avec le plus grand soin. Si le patient n’est pas immunisé (recherches négatives), un sérum par an et le sérum du jour sont testés. Si le patient est immunisé (présence d’Ac) sont choisis: un sérum par pic d’immunisation, un sérum post événement immunisant et le sérum du jour.
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La technique utilisée pour le cross match est la LCT. Les lymphocytes T et B sont isolés grâce aux billes magnétiques recouvertes de CD2 pour les T et de CD19 pour les B. Plusieurs types de CM sont réalisés:
* CM standard
-‐ CM T: lymphocytes T du donneur + sérums receveur -‐ CM B: lymphocytes B du donneur + sérums receveur
* CM pour déterminer la classe de l’Ac: si l’Ac est une IgM le CM se négative à l’ajout du DTT car celui ci casse les ponts disulfure de l’IgM
-‐ CM T: lymphocytes T du donneur + sérums receveur + DTT -‐ CM B: lymphocytes B du donneur + sérums receveur + DTT * CM pour augmenter la sensibilité : ajout d’une antiglobuline
-‐ CM T: lymphocytes T du donneur + sérums receveur + antiglobuline Un cross match positif a un impact clinique s’il est:
- Positif en T et B, IgG Cl I, détectée par phase solide - Positif en B, taux faible Cl I, détectée par phase solide - Positif en B, IgG Cl II, détectée par phase solide
- Positif en T et B ou B seul, IgG Cl I et Cl II, détectée par phase solide - Positif en T et/ou B, IgM anti Cl I ou II
Un cross match positif n’a pas d’impact clinique s’il est:
- Positif en T ou B, Auto Ac, détectée par auto CM, en absence d’allo Ac - Positif en T et/ou B, IgG non HLA, non détectée par phase solide - Positif en T et/ou B, IgM non HLA, CM négatif après DTT [11]
2-2- Description de la méthode de saisie et de calcul statistique
2-2-1- Méthode de saisie
Afin de réaliser ce travail, nous avons utilisé un tableau Excel préalablement établi à partir du fichier informatique du laboratoire d’histocompatibilité du CHIS regroupant toutes les informations concernant le receveur éventuel de rein (RER) et le donneur éventuel de rein (DER).
Ce tableau est subdivisé en plusieurs parties. La première concerne le receveur, elle regroupe: identité, origine ethnique, sexe, âge, groupage ABO, typage HLA Cl I et Cl II, nombre de DER. La seconde partie s’intéresse aux donneurs avec les mêmes caractéristiques que celles du RER. Les autres parties renseignent sur le receveur mais plus particulièrement sur la sérothèque, la greffe, le suivi pré et post greffe et enfin toutes les informations concernant la survie du patient et du greffon.
Le tableau a été renseigné, complété et les données pré existantes vérifiées et mises à jour à l’aide des dossiers de tous les patients admis au service de transfusion sanguine et d’hémovigilance (STSH) entre 2000 et 2015.
Quant à la partie concernant la survie du patient et du greffon, elle a été renseignée pour le CHIS à l’aide des dossiers des patients greffés au niveau du service de
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néphrologie de l’hôpital Ibn Sina. Pour les autres structures de recrutements les renseignements ont été fournis par les chefs de service de néphrologie. (Figure 3)
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Après avoir compléter le tableau Excel, nous avons procédé à des calculs statistiques.
2-2-2- Méthode de calcul
Les calculs statistiques (somme et pourcentage) ont été réalisés à l’aide d’Excel.
3- Résultats
Entre les mois de janvier 2000 et décembre 2015, 979 patients atteints d’une insuffisance rénale chronique ont bénéficié d’un suivi immunologique au laboratoire d’histocompatibilité du CHIS. 237 d’entre eux ont été transplantés au niveau des différents centres hospitaliers du royaume.
Les résultats de cette étude, montrent dans un premier temps les caractéristiques générales des receveurs et donneurs: provenances, âge, sexe, groupe érythrocytaire ABO, antécédents immunologiques et liens de parenté. Dans un deuxième temps, sont relatés les résultats obtenus lors des bilans immunologiques réalisés au laboratoire d’histocompatibilité du CHIS. La troisième partie de ce chapitre rapporte les résultats de survie des greffés et des greffons.
3-1- Caractéristiques des receveurs et donneurs
La figure 4, montre que 55 soit 23,21% patients greffés ont été recrutés au laboratoire d’histocompatibilité entre 2000 et 2005, 64 soit 27% entre 2006 et 2010 et 118 soit 49,79% entre 2011 et 2015.
Figure 4: Répartition des patients en fonction des années de recrutements.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 2000-‐2005 2006-‐2010 2011-‐2015 P ou rc en ta ge s
Suivi d’une cohorte de greffés rénaux au laboratoire d’histocompatibilité du centre hospitalier Ibn Sina
Sur les 237 patients transplantés, il y a 141 soit 59,49% qui ont été greffés au CHU Ibn Sina de Rabat, 48 soit 20,25% au CHU de Casablanca, 19 soit 8,02% à HMIMV, 18 soit 7,59% au CHU de Fès, 7 soit 2,95% à l’Hôpital CZ et seulement 4 patients soit 1,69% ont été greffés au CHU de Marrakech. (Figure 5)
Figure 5: Répartition des patients greffés en fonction de leur structure de recrutement.
Pour ces 237 patients greffés, il y a eu 264 DER, seulement 237 d’entre eux ont fait un don. 76,8% (182) des donneurs sont vivants apparentés, 9,3% (22) sont en EME et 13,9% soit 33 n’ont pas été renseignés. (Figure 6)
Figure 6: Répartition des donneurs selon leurs types.
59% 20%
8% 2%
3% 8%
CHU Rabat Ibn sina CHU Casa Ibn rochd CHU Fès Hassan II CHU Marrakech Med VI CZ HMIMV 76,8% 9,3% 13,9% Vivants EME NR
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Les liens de parenté entre les receveurs et leurs donneurs vivants (182) se répartissent comme suit: sur 74 ascendants, 59 soit 32,42% sont des mères. Dans la fratrie 19,78% (36) sont des sœurs et 15,93% (29) sont des frères. Les épouses donneuses représentent 10,44% soit 19. (Figure 7)
Figure 7: Répartition des donneurs vivants en fonction du lien de parenté les unissant aux receveurs.
L’âge au moment de la greffe est renseigné pour 222 receveurs, il se situe entre 0 et 20 ans pour 35 (15,77%) d’entre eux. 71 receveurs (31,98%) appartiennent à la tranche d’âge 21-30 ans, 48 (21,62%) à la tranche 31-40 ans, 39 (17,57%) à la tranche 41-50 ans, 26 (11,71%) à la tranche 51-60 et 3 (1,35%) sont âgés de 60 ans. (Figure 8)
F
Figure 8: Répartition des receveurs selon leur âge au moment de la greffe.
16% 32% 22% 17% 12% 1% 0-‐20 21-‐30 31-‐40 41-‐50 51-‐60 > 60 59 36 29 19 15 6 3 3 3 2 2 2 1 1 1 0 10 20 30 40 50 60 70 Nombre Lien de parenté
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Quant à l’âge des donneurs, au moment du don, il est renseigné pour 145 d’entre eux, il se situe entre 0 et 20 ans pour 2 donneurs soit 1,38%, 25 donneurs soit 17,24% appartiennent à la tranche d’âge 21-30 ans, 33 soit 22,76% à 31-40 ans, 37 soit 25,52% à 41-50 ans, 38 soit 26,21% à 51-60 et 10 soit 6,9% sont âgés de 60 ans. (Figure 9)
Figure 9: Répartition des donneurs selon leur âge au moment de la greffe.
Parmi les 237 receveurs, 143 soit 60,34% sont de sexe masculin et 94 soit 39,66% sont de sexe féminin. Quant aux 237 donneurs, 53 (22,36%) n’ont pas été renseignés. Sur les 184 renseignés, 56 soit 30,43% sont de sexe masculin et 128 soit 69,56% sont de sexe féminin.
La figure 10 montre le pourcentage de receveurs et donneurs selon leur sexe.
1% 17% 23% 26% 26% 7% 0-‐20 21-‐30 31-‐40 41-‐50 51-‐60 > 60 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% P ourc ent age s % Receveurs Donneurs
Figure 10: Répartition des receveurs et donneurs selon le sexe.
M F
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Dans le système de groupe érythrocytaire ABO, les receveurs se répartissent comme suit: 53,85% (63) sont du groupe O, 29,06% (34) sont du groupe A, et respectivement 13,68% (16) et 3,42% (4) sont des groupes B et AB. Les donneurs se répartissent comme suit: 60,47% (52) sont du groupe O, 26,74% (23) sont du groupe A, 12,79% (11) sont du groupe B. Aucun donneur n’appartient au groupe AB.
Tableau 1: Répartition des groupes ABO chez les receveurs et les donneurs de rein. 35,44% (84) des 237 receveurs, n’ont présenté aucun antécédent immunologique en pré-greffe. 27,43% (65) ont eu un événement immunisant, 52 (21,94%) entre 2 et 5 événements et 5 (2,11%) plus de 5 événements.
31 patients n’ont pas été renseignés sur leurs antécédents d’immunisation.
Tableau 2: Répartition des patients selon le nombre d’antécédents d’immunisation. Sur 122 patients ayant présenté un ou plusieurs événements immunisants, 81,15% (99) ont été transfusés, 9,84 % (12 patientes) ont eu des grossesses, 9,02% (11) ont eu dans leurs antécédents les deux événements.
Tableau 3: Répartition des antécédents d’immunisation par types.
GROUPE ABO NOMBRE DE RECEVEURS %
A 34 29,06
B 16 13,68
AB 4 3,42
O 63 53,85
TOTAL 117 100
GROUPE ABO NOMBRE DE DONNEURS %
A 23 26,74 B 11 12,79 AB 0 0,00 O 52 60,47 TOTAL 86 100 Nombre d'antécédents Nombre de patients % Aucun 84 35,44