Le plasmide GFP-PTS a été transfecté dans des cellules HEK293 exprimant les récepteurs

CD4 et CXCR4 (Vert). Pex14 a été détecté dans les cellules cibles en Immunofluorescence grâce à un anticorps dirigé contre Pex14 (Rouge). La colocalisation du signal GFP-PTS et de Pex14 dans les cellules a été évaluée en microscopie confocale (Merge). L’échelle des images présentées est de 5 µm. B. Les cellules cibles HEK293 exprimant les récepteurs CD4 et co-récepteur CXCR4 transfectées GFP-PTS ont été mises en coculture durant 24 ou 48 h avec des cellules exprimant ou non Env en présence ou non d’un inhibiteur d’autophagie (Spautin1, 50 µM). Le niveau médian de GFP a été quantifié par cytométrie en flux (Analyse FlowJo). Les résultats sont exprimés en taux d’induction comparant les conditions Env- aux conditions Env+ selon les différents traitements.

57 exposées à Env, la taille des précipités semble plus petite que celle retrouvée dans les cellules non exposées à Env et l’ajout d’antiprotéases restaure la taille des précipités de DAB (voir Figure 32). Malheureusement, la qualité des images acquises dans cette expérience ne nous a pas permis de quantifier le nombre et la taille des précipités (représentant les peroxysomes) obtenus.

- Utilisation du DAB en microscopie électronique :

Nous avons, en parallèle, tenté de marquer les peroxysomes au DAB, dans des expériences de TEM, dans des cellules T CD4 après leur coculture avec des cellules exprimant Env. Pour cette expérience, il s’agissait de combiner ce marquage avec une analyse structurale de la cellule. Malheureusement, après plusieurs tentatives, les conditions de fixation des cellules pour la TEM n’ont pas permis de visualiser les précipités de DAB dans les cellules. Nous avons donc choisi d’utiliser d’autres stratégies pour quantifier le nombre et la taille des peroxysomes dans les cellules T CD4 cibles exposées à Env.

3.6.A Quantification de la quantité des peroxysomes par cytométrie en flux

Pour quantifier les peroxysomes dans notre modèle, nous avons utilisé un plasmide permettant l’expression de la protéine GFP couplée à un triplet de séquence d’adressage au peroxysome (PTS : Peroxisome Targeting Signal). En effet, au cours de la biogénèse des peroxysomes, les protéines peroxysomales sont adressées à ces organelles via cette séquence. Nous avons, dans un premier temps, vérifié la validité de ce plasmide en transfectant des cellules cibles HEK.293 (Modèle 2) avec le plasmide GFP-PTS. Les cellules cibles ont ensuite été récupérées et un immunomarquage de la protéine Pex14 a été effectué. On constate une quasi-parfaite colocalisation entre GFP-PTS et Pex14 (voir Figure 33A) confirmant que cet outil est fiable pour identifier les peroxysomes.

Nous avons alors utilisé cet outil pour quantifier les peroxysomes par cytométrie en flux. Pour cela, les cellules cibles HEK.293 exprimant les récepteurs CD4 et CXCR4 (Modèle 2) ont été transfectées avec le plasmide permettant l’expression de GFP-PTS. Puis, ces cellules transfectées ont été mises en coculture avec des cellules exprimant ou non Env durant 24 h ou 48 h avec un traitement, ou non, avec l’inhibiteur d’autophagie Spautin1. Le niveau médian de fluorescence de la GFP a été analysé dans les cellules cibles par cytométrie de flux. Les résultats montrent une diminution du niveau de fluorescence suite à l’exposition à Env (voir

Figure 34 : Dégradation des peroxysomes “matures” induite par Env

Des cellules HEK.293 exprimant les récepteurs CD4 et CXCR4 ont été cocultivées avec des cellules exprimant ou non Env durant 48 h. Les cocultures ont été traitées ou non avec un inhibiteur de l’autophagie (Spautin1, 50 µM). A. Les cellules cibles ont été récoltées et fixées pour immunomarquage de la protéine Pex14. Les cellules ont ensuite été analysées par microscopie confocale. L’échelle est égale à 10 µm. B. Ces images ont ensuite été introduites dans le logiciel d’analyse d’images Cell Profiler pour mesurer l’aire de chaque peroxysome marqué et le classer selon le seuil de 0,7 µm de diamètre. Le logiciel nous indique alors quels sont les peroxysomes considérés au-dessus du seuil choisi. C. La classification réalisée par le logiciel Cell profiler nous as permis de calculer pour chaque cellule le rapport moyen du nombre de peroxysomes « matures » sur le nombre de peroxysomes totaux. Ces résultats sont présentés sous-forme de scatter plot à l’aide du logiciel GraphPad.

58 Figure 33B). L’utilisation de la Spautin1 réverse cet effet indiquant que l’autophagie induite par Env est impliquée dans la diminution de la fluorescence sans ajout de Spautin1. De plus, ces expériences montrent que la diminution du signal augmente avec le temps de coculture.

3.6.B Env induit la diminution du nombre de peroxysomes matures dans les cellules cibles

Suite à l’observation en DAB d’une population hétérogène en taille des peroxysomes en réponse à Env, nous avons voulu étudier ces variations et nous avons choisi la technique d’immunofluorescence. Les peroxysomes ont une taille variable entre 0,1 et 1 µm de diamètre. Bien qu’ils soient capables de fission, les peroxysomes dits « matures », lesquels exercent leur capacité antioxydante via la catalase, sont plus gros que ceux en cours de biogénèse. Pour analyser si Env avait un effet sur la taille des peroxysomes dans les cellules T CD4 cibles, nous avons mis en coculture, durant 48 h, des cellules HEK.293 exprimant les récepteurs CD4 et CXCR4 (Modèle2) avec des cellules exprimant ou non Env. Nous avons également traité, ou non, les cellules avec un inhibiteur de l’autophagie (Spautin1). Les cellules cibles ont ensuite été récoltées, fixées et les peroxysomes ont été marqués avec un anticorps spécifique de Pex14. Les cellules cibles ont ensuite été analysées par microscopie confocale (voir Figure 34). Afin de distinguer les gros peroxysomes, dits « matures », des petits peroxysomes (en cours de biogénèse), nous avons utilisé le logiciel « Cell Profiler ». Ainsi, chaque acquisition au microscope confocal a été réalisée sur le volume entier des cellules cibles. Nous avons fixé un « Z » de 1 µm (pas entre chaque tranche optique) pour chaque image afin d’éviter d’acquérir deux fois le même peroxysome. Le logiciel « Cell Profiler » a été utilisé pour sa capacité à distinguer les peroxysomes dans les cellules cibles et à mesurer leur aire (marquage Pex14). Nous avons fixé un seuil de 0,7 µm de diamètre pour identifier les peroxysomes « matures ». Sur la base de cette mesure effectuée par le logiciel « Cell Profiler », nous avons pu établir, pour chaque image analysée, un rapport du nombre de peroxysomes matures (diamètre >0,7 µm) sur le nombre de peroxysomes totaux. Ces rapports ont été collectés pour chaque image constituant le volume d’une cellule cible. Nous avons pu ainsi obtenir la moyenne des rapports de peroxysomes matures sur les peroxysomes totaux pour chaque cellule.

La comparaison du nombre moyen de peroxysomes matures sur les peroxysomes totaux d’une cellule nous indique que ce rapport est diminué suite au contact avec Env. Cependant, l’inhibition de l’autophagie par la Spautin1 restaure le rapport de peroxysomes matures sur le

Figure 35 : Les peroxysomes colocalisent avec les lysosomes.

Des cellules T CD4 ont été cocultivées durant 48 h avec des cellules exprimant ou non Env en présence d’inhibiteurs des étapes dégradatives de l’autophagie (AP : E64d & Pepstatine A 10 µM respectivement). Les cellules cibles sont ensuite été récupérées et fixées ou immunomarquage des protéines Pex14 (Rouge) et Cathepsine D (Vert). A. Les cellules ont été analysées par microscopie confocale. Les images de microscopie présentées montrent à la fois le marquage Pex14 et Cathepsine D. L’échelle des images Env- est égale à 5 µm. L’échelle des images Env+ est égale à 10 µm. Nous présentons également pour cette condition une région d’intérêt (identifiée par un cadre blanc) à une échelle de 5 µm. Les immunomarquages ont été analysés par le logiciel Imaris qui a pu reconstituer chaque cellule dans son volume. Au sein de ce volume, le logiciel Imaris nous a permis de représenter chaque marquage Pex14 ou Cathepsine D par une sphère de 1 µm (vésicules Rouges pour Pex14 et Vertes pour Cathepsine D). Le logiciel a ensuite pu nous renseigner sur les vésicules Pex14 colocalisant avec Cathepsine D à un seuil de 0,3 µm (vésicules jaunes). Les échelles des images présentées sont semblables à celles de microscopie confocale respectivement. B. Les quantifications de sphères Pex14 totales et de Pex14 colocalisant avec Cathepsine D nous ont permis de calculer le rapport de sphères colocalisant sur le nombre total de celles-ci. Les résultats sont présentés en scatterplot du pourcentage de sphères Pex14 colocalisant avec Cathepsine D par cellule.

59 nombre de peroxysomes totaux dans les cellules exposées à Env. Ensemble, ces résultats suggèrent donc que l’autophagie induite par Env diminue le nombre de peroxysomes « matures » au sein des cellules cibles.

La quantification des peroxysomes « matures » dans le modèle 1 (où les cellules cibles sont des cellules T CD4 et non des HEK.293) est actuellement en cours.

3.7 Les peroxysomes colocalisent avec les lysosomes

Pour définitivement confirmer la dégradation des peroxysomes par l’autophagie, nous avons réalisé des études de colocalisation entre les peroxysomes et les lysosomes. Pour cela, des cellules T CD4 cibles ont été mises en coculture durant 48 h avec des cellules exprimant ou non Env. Les cocultures ont été traitées avec un inhibiteur de la dégradation lysosomale (AP : E64d et Pepstatine A) afin d’optimiser la visualisation des colocalisations. Les cellules cibles ont été récupérées et adhérées à des lamelles de poly-lysine avant d’être fixées pour ensuite procéder à l’immunomarquage. La protéine Pex14 a été révélée avec un fluorophore émettant dans le rouge (Alexa 555) et la Cathepsine D (protéase lysosomale) a été révélée grâce à un anticorps émettant dans le vert (Alexa 488) (voir Figure 35A). Les cellules ont ensuite été analysées par microscopie confocale. Plusieurs tranches optiques d’une même cellule ont été acquises afin de reconstituer tout le volume cellulaire. Les images ont ensuite été analysées grâce au logiciel d’analyse de microscopie confocale Imaris XT. Ce logiciel nous a permis d’observer, dans le volume de chaque cellule, le marquage des peroxysomes (Pex14) et des lysosomes (Cathepsine D) ainsi que leurs colocalisations potentielles. Le logiciel Imaris nous a ensuite permis de modéliser les marquages par des sphères de 1 µm, grâce auxquelles le taux de peroxysomes colocalisant avec des lysosomes (Jaune) a pu être calculé (seuil de colocalisation fixé à 0,3 µm). Pour chaque cellule cible, le nombre de peroxysomes colocalisant avec les lysosomes, rapporté au nombre de peroxysomes totaux a été évalué. Les résultats obtenus sont encourageants et montrent une nette augmentation du nombre de peroxysomes colocalisant avec les lysosomes dans les cellules T CD4 après leur coculture avec des cellules exprimant Env (voir Figure 35B). Ces résultats doivent être reproduits mais sont une preuve supplémentaire que Env induit bien la pexophagie dans les cellules T CD4 cibles.

Figure 36 : PEG-catalase n’est pas intégrée dans les cellules LT CD4

Des cellules cibles T CD4 ou HEK.293 ont été incubées ou non avec de la PEG-catalase (800 unités/mL) durant 48 h. Après 24 h d’incubation, certaines cellules ont reçu une complémentation supplémentaire de PEG-Catalase (800 unités/mL), D’autres cellules ont été lavées aux PBS 24 h avant d’être récupérées. Les cellules cibles ont été analysées par Western Blot pour l’expression de la catalase. La quantité de protéines a été analysée par le niveau d’expression de la GAPDH.

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3.8 Test fonctionnel : Complémentation des cellules cibles avec la catalase

L’ensemble des résultats obtenus indiquent que l’autophagie induite par Env dégrade sélectivement les peroxysomes matures dans les cellules T CD4 cibles. Ainsi, privées de ces organelles à activité antioxydante, les cellules cibles ne seraient plus en mesure de lutter contre l’accumulation des ROS induite par Env, les conduisant à la mort par apoptose. Afin de valider définitivement cette hypothèse, nous souhaitons complémenter les cellules cibles avec de la catalase et tester la capacité de Env à induire l’apoptose dans ces cellules complémentées. Pour ce faire, nous avons utilisé deux approches. La première vise à traiter les cellules cibles avec une catalase modifiée avec du PEG (PolyEthylèneGlycol) (PEG-catalase). Cette modification doit permettre à la catalase de pénétrer dans les cellules cibles avant leur coculture avec des cellules effectrices. La deuxième approche vise à obtenir des lignées stables de cellules T CD4 cibles surexprimant la catalase après transfection rétrovirale.

- Utilisation de la PEG-catalase :

La catalase couplée au poly-éthylène-glycol (PEG-catalase, Sigma Aldrich) a été utilisée par d’autres équipes pour sa capacité à traverser les membranes cellulaires (Ginet et al. 2014). Après plusieurs tentatives, nous avons pu mettre en évidence que ce composé ne pénétrait pas dans nos cellules T CD4 ou HEK.293 cibles (Figure 36). Nous avons donc abandonné cette stratégie de complémentation.

- Utilisation des lignées surexprimant la catalase :

Pour obtenir les lignées de cellules T CD4 cibles surexprimant la catalase, nous avons transfecté des cellules HEK.293 avec une combinaison de plasmides : un plasmide exprimant les protéines d’empaquetage d’un rétrovirus murin (pc57gp), un plasmide permettant l’expression de l’enveloppe du VSV (VSV-G) et un plasmide rétroviral permettant l’expression de la GFP seule (pMIG) ou de la catalase et de la GFP simultanément (pMIG-catalase). Après 48 h de transfection, les surnageants contenant les particules virales, générées à partir de ces trois plasmides, ont été récupérés et ont été utilisés pour transduire des cellules T CD4. Après 48 h, nous avons pu distinguer les cellules transduites grâce à l’expression de la GFP. Ces cellules transduites ont été clonées par dilution limite. Plusieurs clones ont été obtenus et nous avons vérifié l’expression de catalase et de la GFP dans trois d’entre eux (voir Figure 37A).

Figure 37 : Complémentation des cellules cibles en catalase et test du niveau d’apoptose suite à la complémentation en catalase