Culture cellulaire

6.1.A Modèle 1

Cellules cibles : cellules T CD4 en suspension exprimant les récepteurs CD4 et CXCR4 (voir Figure 39). On utilise soit :

- Des cellules de lignée CEM (A201.CD4/403). Ce sont des lymphoblastes exprimant un récepteur CD4 tronqué en position 403. Le récepteur CD4 conserve donc sa propriété de reconnaissance par le gp120 mais n’est en revanche plus capable de transmettre les signaux intracellulaires. Ces cellules sont cultivées à 37°C sous atmosphère saturée en humidité de CO2 à 5% en milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (SVF : Sérum de veau foetal) et des antibiotiques (1% de pénicilline-streptomycine) et une pression de sélection de G418 (1 mg/mL). Les cellules sont maintenues à une densité de 5.105 cellules/mL.

- Des cellules T CD4 primaires purifiées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique par une sélection négative à l’aide du kit d’isolation de CD4 (Stem Cell Technology).

Cellules effectrices : cellules adhérentes HEK.293 stablement transfectées avec un plasmide permettant l’expression de Env (HEK.Env). Des cellules de la même lignée cellulaire n’exprimant pas Env sont utilisées comme contrôle (HEK.293T). Ces cellules sont cultivées à 37°C sous atmosphère saturée en humidité de CO2 à 5% en milieu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin et des antibiotiques (1% de pénicilline-streptomycine). Une pression de sélection de méthotrexate (2 µM) est utilisée pour la culture des cellules HEK.Env.

Coculture : Les cellules effectrices adhérentes (0.5.10⁶ HEK.293T et HEK.Env) sont lavées puis mises en plaque la veille de la coculture et les cellules T CD4 cibles, sont maintenues à une densité de 5.105 cellules/mL dans les conditions de culture précédemment décrites. Le jour de la coculture, les cellules T CD4 cibles exprimant les récepteurs CD4.403 et CXCR4 sont lavées puis reprises en milieu RPMI complet sans pression de sélection pour être enfin ajoutées en plaque aux cellules adhérentes (1.106/mL). La coculture des cellules est gardée à

Figure 40 : Description du modèle cellulaire de coculture de cellules adhérentes cibles

L’expression de la gp120 à la surface des cellules 8E5 et T CD4 a été analysée par cytométrie de flux après incubation des cellules avec du PBS (histogramme blanc) ou avec du PBS contenant un anticorps polyclonal humain anti-gp120 (histogramme noir). Les anticorps liés ont été détectés avec un anticorps secondaire de chèvre Ig anti-humain marqué au FITC. L’expression des récepteurs de surface CD4 et CXCR4 des cellules cibles HEK.CD4.CXCR4 a été réalisée après incubation des cellules avec du PBS (histogramme blanc) ou avec un anticorps anti-CD4 (histogramme noir) ou anti-CXCR4 (histogramme gris) mAb à 10 µg/mL. Les anticorps liées ont été détectés à l’aide d’un anticorps de chèvre Ig anti-souris marqué au FITC. L’intensité de fluorescence est rapportée en mode logarithmique par un cytomètre de flux EPICS XL4.

73 37 °C sous atmosphère saturée en humidité de CO2 à 5% pendant 48 h. Les cellules cibles ont ensuite été récupérées pour être analysées.

6.1.A.1 Purification cellules T CD4

Des cellules T CD4 primaires sont purifiées à partir de poches de sang obtenues auprès de l’Etablissement Français du Sang (EFS). De façon pratique, le sang est déposé délicatement sur du FicollTM afin d’isoler les PBMC. Après centrifugation, l’anneau de cellules est récupéré et les cellules sont lavées au PBS puis comptées pour connaître le total de cellules récupérées. Ces cellules font ensuite l’objet d’une sélection négative selon le protocole du kit « Easy Sep Negative Selection Human CD4 T cells » (Stem Cell Technology #19052). Pour cela, les cellules sont préparées à une concentration de 50x106 cellules/mL dans une solution de PBS, SVF 2% et EDTA 1 mM. Le cocktail d’anticorps « EasySep®Human CD4+T Cell Enrichment Cocktail » est ajouté aux cellules à raison de 50 µL/mL puis incubé à température ambiante pendant 10 minutes. Les billes magnétiques qui vont se coupler aux anticorps « EasySep®D Magnetic Particles » sont ensuite ajoutées aux cellules à raison de 100 µL/mL de cellules. Ce mélange est incubé à température ambiante pendant 5 minutes après avoir été mélangé à la pipette. Le volume est amené à 2,5 mL par addition du tampon PBS-SVF2%-EDTA1mM et mélangé. Les cellules sont ensuite placées dans un aimant « EasySep®Magnet » puis incubées pendant 5 minutes supplémentaires à température ambiante. L’aimant est ensuite inversé en un mouvement continu sans à-coups et les cellules T CD4 sont collectées. Les cellules sont ensuite lavées et cultivées en milieu RPMI complet sans antibiotique avant d’être utilisées en coculture dans notre modèle d’étude.

6.1.B Modèle 2

Cellules cibles : Cellules adhérentes HEK.293 stablement transfectées avec un plasmide permettant l’expression de CD4.403 et CXCR4 en surface (HEK.CD4.03/CXCR4) (voir Figure 40). Ces cellules sont cultivées à 37 °C sous atmosphère saturée en humidité de CO2 à 5% en milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin et des antibiotiques (1% de pénicilline-streptomycine). Une pression de sélection de G418 (1 mg/mL) et de Zéocine (250 µg/mL) est utilisée pour la culture des cellules HEK.CD4.403/CXCR4.

Cellules effectrices : Cellules exprimant ou non Env. La lignée cellulaire 8.E5 exprimant Env est dérivée de cellules T CEM contenant une seule copie du VIH-1 intégrée et incapable de

74 produire des virus infectieux dû à une mutation au niveau de la RT. Ces cellules sont cultivées à 37 °C sous atmosphère saturée en humidité de CO2 à 5% en milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin et des antibiotiques (1% de pénicilline-streptomycine). Les cellules de la lignée cellulaire A201.CD4/403 n’exprimant pas Env sont utilisées comme contrôle.

Coculture : Les cellules cibles adhérentes (0.5.10⁶ cellules HEK.CD4.403/CXCR4) sont lavées puis mises en plaque la veille de la coculture et les cellules 8.E5 et A201.CD4.403 sont maintenues à une densité de 5.105 cellules/mL dans les conditions de culture précédemment décrites. Le jour de la coculture, les cellules en suspension 8.E5 et A201.CD4.403 (1.106 cellules/ml) exprimant ou non Env sont lavées puis reprises en milieu RPMI complet sans pression de sélection pour être enfin ajoutées en plaque aux cellules adhérentes. La coculture des cellules est gardée à 37 °C sous atmosphère saturée en humidité de CO2 à 5% pendant 48 h. Les cellules en suspension sont retirées de la coculture afin de récupérer les cellules cibles pour être analysées.