Phase de la reprogrammation et signature moléculaire

Figure n°9 : Phases de la reprogrammation et phénotype associé.

Figure n°10 : « Carte routière » de la reprogrammation de MEF par les facteurs OSKM en système inductible à la doxycycline.

A) Identification basée sur les marqueurs Thy1/SSEA1/Oct4-GFP (Polo et al., 2012). B) Identification basée sur

les marqueurs CD44/ICAM1/Nanog-GFP O’Malle et al., . D’apr s Theunissen and Jaenisch, 2014.

Phase de la reprogrammation et signature moléculaire

Il est importa t de soulig er ue la plupart des tudes porta t sur l’ide tificatio des m ca ismes de

la reprogrammation, ont été réalisées avec des MEF, donc des cellules embryonnaires de souris en

exprimant les facteurs OSKM par un système inductible à la doxycycline. Ces premières expériences

comportant également des systèmes rapporteurs Oct4-GFP (Green Fluorescent Protein) ou

Nanog-GFP ont montrée que les cellules en cours de reprogrammation passaient par un nombre

d'intermédiaires définis avant d'attei dre l' tat pluripote t. L’a al se du tra scriptome et du

prot ome des MEF e cours de reprogrammatio , otamme t grâce à des tech i ues d’a al se de

cellule u i ues, o t permis d’ide tifier phases de reprogrammatio : l’i itiatio , la maturatio et la

stabilisation (Figure n°9) (David and Polo, 2014).

1. L’i itiatio

Dura t la phase d’i itiatio , les cellules vo t su ir u e MET, u cha geme t du r thme de

prolif ratio et u e augme tatio de l’expressio des mar ueurs précoces de la pluripotence

(Samavarchi-Tehrani et al., 2010; Polo et al., 2012; Hansson et al., 2012).

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L’a al se des i term diaires de reprogrammation révèle que les cellules perdent le marqueur Thy1

(ou CD90 ; marqueur exprimé par les fibroblastes) ainsi que le marqueur CD44 au profit de SSEA1

(marqueur des ESC murines) et de la phosphatase alcaline (Ph.A), durant la première semaine

Bram ri k et al., ; Polo et al., ; O’Malle et al., ). Ces signatures sont associées à une

première vague de changements transcriptionnels globaux qui atteint un pic à environ 3 jours suivant

l’expressio d’OSKM chez les MEF. Ces cha geme ts, e plus de la prolif ratio , sem le t impacter

le métabolisme cellulaire, l’orga isatio du c tos uelette et de multiples processus du

développement (Polo et al., 2012). E outre, plusieurs groupes o t mo tr ue l’ac uisitio de la

r sista ce à l’apoptose et à la se esce ce tait u v eme t pr coce importa t de cette premi re

phase pour le succès de la reprogrammation (Utikal et al., 2009).

L’expressio de FT m se ch mateux est r prim e avec u e dimi utio de Snail1/2, Zeb1/2 et Slug au

profit de gènes épithéliaux comme Cdh1 (E-cadhérine) et EpCAM (CD326) ainsi que des marqueurs de

pluripotence très précoces comme Fbxo15, Ph.A, de facteurs de la r plicatio de l’ADN Poli, Rfc4),

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de progression du cycle cellulaire (Ccnd1/2) et du stress cellulaire (Cdkn1/2a) (Stadtfeld et al., 2008a;

Mikkelsen et al., 2008; Samavarchi-Tehrani et al., 2010). Des changements similaires sont

o serva les au iveau du prot ome avec l’expressio de prot i es de r gulatio de la pluripote ce

Jarid , Tcf mais aussi des r gulateurs glo aux de la tra scriptio Mediator, RNA Pol II, Nurd…etc.

(Hansson et al., 2012). La phase d’i itiatio est do c d fi ie comme le comme ceme t de la

reprogrammatio jus u’à l’o te tio de l’expressio des premiers mar ueurs associés à la

pluripotence.

Plusieurs exp rie ces o t t r alis es afi de compre dre l’importa ce de la MET da s le processus

de reprogrammatio compris chez l’Homme. L’utilisatio de petits ARN i terf re ts shRNA ; small

hairpin RNA) ciblant les transcrits de l’E-cadhérine ou l’additio de liga ds des r cepteurs du TGF-β

r duise t l’efficacit du processus de reprogrammatio ta dis ue des i hi iteurs des r cepteurs du

TGF-β ou la promotion des miR 302-367 favorisent la MET et donc la reprogrammation (Ichida et al.,

2009; Subramanyam et al., 2011).

Après que la majorité des cellules a pu initier ce processus, seules certaines, notamment certains

intermédiaires SSEA1

chez la souris ou TRA-1-60

chez l’Homme, vo t progresser vers la

pluripotence (Buganim et al., 2012; Tanabe et al., 2013). En effet, la majorité des cellules (90-95%)

devient e suite r fractaires et c’est fi aleme t cette tra sitio de la phase d’i itiatio à la phase de

maturation qui est limitant dans le processus de reprogrammation.

2. La maturation

La phase de maturatio est caract ris e par u e p riode de late ce suivie d’u e seco de vague de

changements transcriptionnels et protéomiques durant les jours 9 à 12 chez les MEF en cours de

reprogrammation et où se produit l’apparitio de g es associ s à la pluripote ce et de g es

épidermiques.

Ces cha geme ts co duise t à l’augme tatio de l’expressio de g es des CSP tels ue Fbx015,

Oct4, Sall4 puis Nanog, Esrrb, Nr5a2 et des g es de r po se à l’h poxie (Polo et al., 2012; Hussein et

al., 2014; Mathieu et al., 2014). Il est important de signaler que la plupart de ces cibles sont

également réactivées durant la reprogrammation des fibroblastes humains. De plus, la fin de la phase

de maturatio est mar u e par l’expressio e dog e de Sox2, Dppa4 et l’i itiatio de l’activatio

du réseau de pluripotence endogène (Polo et al., 2012; Golipour et al., 2012; Hussein et al., 2014).

Ces observations ont permis de conclure que le mécanisme de reprogrammation des MEF par les

facteurs OSKM comprenait une phase précoce stochastique durant laquelle plus de 90% des cellules

sont réfractaires et doivent initier les bons changements moléculaires indépendamment du chemin

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emprunté pour les acquérir. Le modèle prévoit ensuite une phase déterministe où les changements

de sig ature s’effectue t de manière « hiérarchique » vers des marqueurs identifiés comme Tbx3,

Nanog ou Esrrb, co duisa t à l’o te tio d’iPSC (Buganim et al., 2013).

Ces changements observés dans les populations Thy1

/SSEA1

/Oct4

en cours de reprogrammation

concordent avec ceux observés dans les populations CD44

/CD54

conduisant à la phase de

stabilisation Polo et al., ; O’Malle et al., .

3. La stabilisation

Cette phase d ute ua d les iPSC devie e t i d pe da tes de l’expressio des tra sg es et

englobent tous les changements qui survienne t apr s l’ac uisitio de la pluripote ce. Ces

cha geme ts permette t à la cellule d’ac u rir u tat pluripote t complet, tr s proche de celui des

ESC. Ils comportent notamment la réactivation des deux copies du chromosome X chez les iPSC