Démarche expérimentale

Les séquences complémentaires aux ADNc cibles sont en lettres majuscules. Les sites de restriction sont soulignés.

Rosetta™ DE pLysS

16°C sur la nuit ; milieu LB ;

Aucune 10mM Tris pH 7.8, 50mM Na2HPO4, 500mM NaCl et 10mM Imidazole

Dul ecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS): 2.7mM KCl, 1.5 mM KH2PO4,

138mM NaCl, 8mM Na2HPO4 + 10% Glycérol

^{16°C sur la nuit ; milieu LB ;}, mM d’IPTG

^{16°C sur la nuit ; milieu LB ;}mM d’IPTG ^{10mM Tris pH 7.8, 50mM Na2HPO4,}500mM NaCl et 10% Glycérol

^{16°C sur la nuit ; milieu LB ;}mM d’IPTG

DPBS + 10% Glycérol

^{BL21 (DE3)}^pLysS

20°C sur la nuit ; milieu LB ;

Rosetta™ DE pLysS 16°C sur la nuit ; milieu TB ;

, mM d’IPTG apr s h à 4°C

Adsorption par échanges

d’a io s puis

chromatographie

d’ cha ges de catio

20mM Tris pH 8.5, 100mM NaCl, 10% Glycérol, 0.5mM EDTA et 10mM Imidazole mM Tris pH . , ≈ mM NaCl, % Glycérol, 0.5mM EDTA et < 1.8mM Imidazole

Rosetta™ DE pLysS

16°C sur la nuit ; milieu TB ;

, mM d’IPTG ^Aucune ^{10 mM Tris pH 7.5, 50mM Na2HPO4,}500mM NaCl et 10mM Imidazole ^{DPBS + 10% Glycérol}

^{3h 37°C ; milieux LB ou TB ;}, mM d’IPTG

Adsorption par échanges

d’a io s puis

chromatographie

d’ cha ges de catio

50mM Tris pH 7, 100mM NaCl et 10mM

Imidazole ^{50mM Tris pH 7, 1M NaCl, 10% Glycérol}

1h 37°C puis 2h 30°C ; milieu LB avec 0,5M Sorbitol; , mM d’IPTG apr s mi à 47°C

3h 37°C ; milieu LB ; 0,5mM

d’IPTG ^{Lavages des C.I} ^{50mM Tris pH 7.5}

* 50mM MES pH 6, 9.6mM NaCl, 0.4mM KCl, 1mM EDTA, 0.4M Sucrose, 0.75M Guanidine-HCl, 0.5% Triton-X100, 0.05%

polyéthylène glycol (PEG) 3550, 1mM DTT et 10% Glycérol

18°C sur la nuit ; milieu TB avec 0,5M NaCl + 1% Glucose

+ mM B taï e; mM d’IPTG

après 30min à 47°C

3h 37°C ; milieu LB ; 0,5mM

d’IPTG ^{Lavages des C.I} ^{50mM Tris pH 7.5}

* 50mM Tris pH 8.5, 9.6mM NaCl, 0.4mM KCl, 1mD EDTA, 0.5M Arginine, 0.5M Guanidine-HCl, 0.05% PEG 3550, 1mM

Ce projet vise à cr er u vecteur recom i a t i ova t et s curis pour la g ratio d’iPSC utilisant

le CPP MD. Dans ce contexte, les objectifs sont multiples et se scindent en 3 parties :

1) Effectuer une preuve de concept avec le facteur de transcription Oct4.

Il s’agit de d velopper le vecteur MD et de le comparer à celui d riv du s st me de

sécrétion de type 3 de Pseudomonas aeruginosa présent au laboratoire et au peptide R9

représentatif de la reprogrammation protéique dans la littérature. Pour cela, il est nécessaire

de : (i) Les produire et les purifier, (ii) vérifier la fonctionnalité des protéines Oct4 et (iii)

tester l’achemi eme t da s les cellules et l’activatio tra scriptio elle de g es d’i t r t.

2) Développer le vecteur MD pour les autres protéines de reprogrammation : Sox2, Nanog,

Lin28, Klf4 et c-Myc, les produire et les purifier.

3) Générer des cellules souches pluripotentes induites.

A cette fi , i utiliser le virus Se dai, repr se tatif d’u vecteur efficace, pour g rer des

iPSC à partir de cellules humaines (ii) tester notre vecteur da s la g ratio d’iPSC

81

83

I. Plasmide et s st e d’e p essio

A. Génération des plasmides

1. Obtention des séquences codantes

Les séquences des ADN complémentaires (ADNc) utilisés pour cette étude ont été obtenues soit par

réaction de polymérisation en chaîne (PCR) soit par synthèse (Genecust, Luxembourg). Les séquences

des gènes synthétiques destinés à une production en E. coli ou D. melanogaster ont été optimisées

par le prestataire pour u e meilleure expressio chez l’orga isme d’i t r t. Les PCR so t r alis es

avec la polymérase Phusion-HF (New England Biolabs) suivant le protocole du fournisseur. Le tableau

n°5 récapitule les amorces utilisées dans cette étude.

Tableau n°5 : Liste des amorces utilisées pour les réactions de PCR.

Nom Sé ue ce 5’3’ restriction Sites de d’iVecteur tégration

Oct4-F gagcatatgGCGGGACACCTGGCTTC NdeI pET15b

Oct4-R ctcggatccGTTTGAATGCATGGGAGAGC BamHI pET15b

R9-Oct4-F gagcatatgcgtcgccgtcgccgtcgtcgccgtcgtGCGGGA

CAC

NheI pET15b

R9-Oct4-R ctcggatccGTTTGAATGCATGGGAGAGC BamHI pET15b

Oct4-F (pour ExoS

) caggatccGCGGGACACCTGGCTTC BamHI pEAi

Oct4-R (pour ExoS

) cacatatgGTTTGAATGCATGGGAGAGC NdeI pEAi

ExoS54-Oct4-F gagcatatgATGCATATTCAATCGCTTCAGCAG NdeI pET15b

ExoS54-Oct4-R CTCGAGgctagcGTTTGAATGCATGGGAGA XhoI pET15b

Oct4-F (pour MD) gaggcggccgcaGCGGGACACCTGGCTTC NotI pET15b-MD

Oct4-R (pour MD) gaggctagcGTTTGAATGCATGGGAGAGC NheI pET15b-MD

Sox2-F (pour MD) gaggcggccgcaTACAACATGATGGAGACGGAGC NotI pET15b-MD

Sox2-R (pour MD) gaggctagcCATGTGTGAGAGGGGCAGTG NheI pET15b-MD

MD-BLa-F ccatatgAAGCGATACAAGAATCGGGTGGC NdeI pET15b

MD-BLa-R ctcgagGCTAGCCCAATGCTTAATCAGTGA XhoI pET15b

MD-Nanog-F ccatatgGAATGCGATAGCGAACTGGAAAT NdeI pET15b

MD-Nanog-R ggatccTTAAACGTCCTCCGGCTGCATAT BamHI pET15b

MD-Lin28-F ccatatgGAATGCGACTCTGAACTGGAAAT NdeI pET15b

84

MD-Klf4-F ccatatgGAGTGCGACTCTGAGCTGGAGAT NdeI pET15b

MD-Klf4-R ggatccTTAGAAGTGACGTTTCATGTGCAG BamHI pET15b

MD-c-Myc-F ccatatgGAATGTGATAGCGAACTGGAGAT NdeI pET15b

MD-c-Myc-R ggatccTTACGCGCAGCTGTTGCGCAGCTG BamHI pET15b

MD-Klf4-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttagaaaacctgtac

ttccagggtAAGCGTTACAAGAACCGTGTGGCGA

AttB1 pDON-R

MD-Klf4-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttattaGAAGTG

ACGTTTCATGTGCAGCGCC

AttB2 pDON-R

MD-c-Myc-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttagaaaacctgtac

ttccagggtAAGCGTTACAAGAACCGTGTCGCTT

AttB1 pDON-R

MD-c-Myc-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttattaCGCGCA

GCTGTTGCGCAGCTGTTCC

AttB2 pDON-R

MD-Klf4-F aaaagaatgcggccgcgaagatct BglII pMT-BIP

MD-Klf4-R ggatcccgccggcgcgccgtttaaacaaagcttta PmeI pMT-BIP

MD-c-Myc-F aaaagaatgcggccgcgaagatct BglII pMT-BIP

MD-c-Myc-R ggatcccgccggcgcgccgtttaaacaaagcttta PmeI pMT-BIP

Les caractéristiques des séquences nucléotidiques et des protéines codées correspondantes sont

indiquées dans le tableau n°6.

2. Clonages

Les plasmides et produits de PCR sont digérés pendant 10 minutes à 37°C grâce aux enzymes de

restriction appropriées (New England BioLabs). Après purification sur gel des produits de digestion

grâce au kit "PCR clean-up, gel extraction" (Macherey-Nagel), une ligation est réalisée à partir de 50

ng de vecteur avec un ratio moléculaire vecteur : insert de 1 : 3, grâce au kit "Rapid DNA Ligation Kit"

(Roche Applied Science). Un contrôle avec le vecteur seul est effectué. Le produit de ligation est

ensuite ajouté aux bactéries chimio-compétentes DH5α Life Tech ologies à u ratio plasmide :

act ries de , l : l. La tra sformatio est r alis e par choc thermi ue pe da t 4 seco des à

42°C. 200µL de milieu S.O.C (Life Technologies) sont ajoutés aux bactéries transformées et le

Nom Sé ue ce 5’3’ _restriction^{Sites de} _d’i^Vecteur_tégration

MD-Klf4-F ^{aaaagaatgcggccgcgaagatct} ^BglII ^pMT-BIP

MD-Klf4-R ^{ggatcccgccggcgcgccgtttaaacaaagcttta} ^PmeI ^pMT-BIP

ADNc ^Taille

(en nt) ^Référence ^{Protéine correspondante}