Le cocktail de reprogrammation

Comme ous l’avo s vu pr c demme t, le cocktail de reprogrammatio OSKM Yama aka est le

plus souvent utilis et l’associatio OSNL Thomso reste tr s mi oritaire. Cepe da t, il existe

d’autres associatio s possi les pour reprogrammer les cellules somati ues avec otamme t des

protéines différentes (Figure n°12) (Xiao et al., 2016).

En effet, puisque les FT Klf4 et c-Myc sont des proto-oncogènes, des études se sont focalisées sur

leur remplacement. Le FT L-Myc, plus court que son homologue c-Myc au niveau des domaines

N-terminaux régulant la transcription, possède un potentiel oncogénique plus faible (Cole and Cowling,

2008) et permet de reprogrammer des iPSC humaines de manière efficace et plus sécurisée que

c-Myc et N-c-Myc (Nakagawa et al., 2010; Okita et al., 2011). Les facteurs Klf2 et Klf5 quant à eux

peuvent remplacer Klf4 puisque ces protéines possèdent des rôles redondants (Jiang et al., 2008).

L’associatio OSK peut reprogrammer des fi ro lastes murins et humains et démontre que c-Myc

’est pas i dispe sa le à la g ratio d’iPSC, ie ue le om re d’iPSC o te ues soit vraime t plus

faible, sur une cinétique plus longue (Nakagawa et al., 2007).

Figure n°12 : Su stituts pou les FT OSKM lo s de la g n ation d’iPSC.

D’apr s Xiao et al., 2016.

Comme ous l’avo s vu pr c demme t pour les vecteurs, certai s miR peuve t galeme t

remplacer certains facteurs comme c-M c avec otamme t, l’utilisatio du « cluster » miR-302-367

mais galeme t ie d’autres (Xiao et al., 2016).

Les prot i es de reprogrammatio so t g raleme t choisies puis u’elles poss de t u des rôles

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l’apoptose et de la s esce ce , activent le réseau de pluripotence, ont une action directe ou

i directe sur la modificatio des histo es ou e core la d m th latio de l’ADN r gulateurs

épigénétiques), comme cela a été montré lors du criblage des candidats enrichis dans les ESC lors de

l’ tude i itiale (Takahashi and Yamanaka, 2006). Des études ont aussi remplacé les autres facteurs

OS (Figure n°12) et NL ; Esrrb a notamment été utilisé en remplacement et a permis de générer des

iPSC (Feng et al., 2009). A co trario, des tudes r ce tes o t mo tr la g ratio d’iPSC avec des

« spécificateurs de lignage », c’est-à-dire des protéines de régulation fortement exprimées dans une

lignée cellulaire comme les FT Gata / ou Pax . Ces r gulateurs de lig e, à l’ uili re e tre eux,

permettent de contrer les forces de spécification entre mésendoderme et ectoderme, conduisant à

un état pluripotent (Shu et al., 2013).

Des variations élevées de qualité et de potentiel de différenciation des iPSC obtenues ont été

observées à cause justement de ce choix des facteurs de reprogrammation. Ainsi, il a été montré en

valua t le pote tiel de compl me tatio t traploïde, ue l’associatio SNEL : Sall4, Nanog, Esrrb et

Lin28a génère des iPSC de meilleure qualité à partir de MEF avec le cocktail OSKM (Buganim et al.,

2014).

Des petites molécules chimiques (SM ; Small Molecules) ont également été utilisées pour remplacer

des FT mais aussi pour promouvoir un effet épigénétique, métabolique, sur la signalisation cellulaire

impliquée chez les ESC et/ou facilitant la reprogrammation (Figure n°13) (Federation et al., 2014). On

peut citer par exemple la vitamine C avec son rôle antioxydant et de cofacteur des enzymes TET

(Ten-eleven Translocation , assura t la d m th latio de l’ADN et facilita t l’o te tio d’u tat

pluripotent (Esteban et al., 2010), mais aussi l’utilisatio de VPA comme i hi iteur d’histo e

déacétylase (iHDAC), permettant de conserver des marques épigénétiques actives pour la

transcription de gènes impliqués dans la pluripotence et en remplacement du facteur c-Myc

(Huangfu et al., 2008a).

Des iPSC murines ont pu être générées avec Oct4 uniquement et en présence des SM suivantes :

VPA, CHIR99021 (inhibition de Glycogen Synthase Kinase-3β [GSK-3β] ui permet l’activatio de la

voie Wnt), 616452 (inhibant le TGF-β et permettant de promouvoir la MET) et Tranylcypromine

i hi iteur d’H K4 d m th lase permetta t de co server des mar ues permissives à la tra scriptio

(VC6T ; Li et al., 2011). Chez l’Homme, des essais ont été réalisés également avec du Butyrate

(iHDAC), A-83-01 (inhibiteur TGF-β), PS48 (inhibiteur Phosphoinositide-dependent protein kinase 1 ;

Conversion de la respiration mitochondriale vers la glycolyse) et PD0325901 (inhibiteur

Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular signaling-Regulated Kinase : MAPK/ERK) sur 8 semaines avec

une efficacité de 0.0004% (Zhu et al., 2010).

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La combinaison de SM a même permis de générer des iPSC murines sans apport de FT et donc sans

utiliser de vecteurs : des « chemical iPSC » (ciPSC ; Hou et al., 2013). Dans cette étude, les auteurs ont

pu cribler 10 000 composés capables de remplacer Oct4, grâce au rapporteur Oct4-GFP

dans des

MEF exprimant SKM, et ont identifié les 6 SM suivantes : VC6T plus Forskoline (activateur de

l’Ad late C clase et -deazaneplanocin A (DZnep ; inhibiteur de la S-adenosylhomocystéine

hydrolase ; modificatio pig ti ue VC TFZ . U e fois les colo ies d’iPSC apparues il reste

important de signaler que la reprogrammation se termine et se stabilise dans un milieu 2i (2

i hi iteurs compos de CHIR et de PD permetta t d’am liorer la reprogrammatio

des iPSC en phase tardive. Cette étude démontre le potentiel des SM dans le remplacement des

facteurs et l’ ta lisseme t de lapluripote ce. Cepe da t, des ciPSC humai es ’o t pas e core t

générées à ce jour.

Figure n°13 : Modulation chimique des voies de signalisation et des modifications épigénétiques clés pour la

g n ation d’iPSC.

Mécanismes principaux : Inhibition TGF-β permet de promouvoir la MET lors des phases précoces de la

reprogrammation ; Inhibition GSK-3β active la voie W t ui l ve la r pressio des g es de pluripote ce ;

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reprogrammation des principaux types cellulaires.

D’apr sGonzález et al., 2011