Phase analytique et post-analytique 1. Dosage des protéines totales

Le dosage de la protidémie a été réalisé par technique colorimétrique de Biuret sur l’automate ARCHITECT Ci8200 (figure 2).

En présence d’ions cuivriques, les liaisons peptidiques vont former des complexes stabilisés par des liaisons ioniques grâce à l’oxygène du carbonyle, et par des liaisons de coordination grâce à l’azote peptidique, d’où apparition de coloration violet pourpre.

L’intensité de la coloration est en fonction du nombre de liaisons peptidiques par gramme de protéines, alors que le maximum d’absorption se situe entre 530-550 nm, il varie selon la nature de la protéine. La protidémie normale chez l’adulte est de 62 à 85g/l.

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Figure 2: Automate Architect Ci8200 (Laboratoire de Biochimie et de toxicologie, HMIMV).

II.2.1.2.2. L’électrophorèse des protéines sériques :

L’électrophorèse des protéines est le premier examen à réaliser dans le cadre d’un diagnostic biologique d’Igm. Elle demeure un examen simple, peu onéreux actuellement totalement automatisé. Elle représente une analyse très utilisée en biologie clinique pour séparer les différentes fractions protéiques contenues dans un milieu complexe comme le sérum ou les urines. Elle vise à séparer en différentes fractions, sous l'influence d'un champ électrique et sur un support judicieusement choisi selon le contexte de la mise en œuvre de la technique, l'ensemble des protéines circulantes. De ce fait les protéines sont

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séparées en fonction de leur mobilité électro phorétique dans un tampon alcalin de faible molarité, donc elles se déplacent dans un sens déterminé, qui dépend du pH de la solution étudiée et du pH isoélectrique des protéines

Les techniques électrophorétiques ont connu une évolution considérable au fil du temps, en terme de support, rapidité et sensibilité d’où l’existence de nombreuses méthodes pour la réalisation de cet examen. Au service de Biochimie de l’HMIMV la technique la plus employée est celle de l’EC sur le Capillarys® de chez Sebia (depuis juin 2008), le gel d’agarose sur l’Hydrasys® de la même société reste limité car cette technique est semi-automatique, elle est utilisée en cas de rupture de stock ou de panne de Capillarys®. Par ailleurs, le suivi des patients doit se faire avec la même technique électrophorétique.

Principe de l’électrophorèse sur gel d'agarose (Hydrasys®)

Les échantillons sont déposés à l’aide d’une micropipette ou d’une pipette de transfert dans des encoches créées dans le gel à partir d’un gabarit lors du coulage. Grace à leur densité, les échantillons sont submergés dans la solution tampon et demeurent dans les puits.

L’appareil d’électrophorèse est branché à une source de courant continu direct et mis sous tension. Les molécules chargées contenues dans les échantillons pénètrent alors le gel à travers des capillaires.les molécules dont la charge nette est négative migrent vers l’électrode positive de l’appareil d’électrophorèse (anode), alors que les molécules dont la charge nette est positive migrent vers l’électrode négative (cathode). Dans une certaine fourchette, plus le champ électrique est fort, plus les molécules migrent rapidement. Le tampon sert à la fois de conducteur à l’électricité et de contrôle

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du pH. En effet, le pH influence la charge et la sensibilité des molécules biologiques.

L’électrophorèse sur gel d’agarose (Hydrasys®) est une technique semi-automatisée permettant la migration et la séparation des protéines sériques en tampon alcalin (pH = 9,2) sur un gel d’agarose (Hydragel® protéine 15/30 ou Hydragel® protéine 54). Les protéines sont séparées en cinq fractions : albumine, α1- et α2-globulines, β-globulines et γ-globulines. Ces protéines séparées sont colorées par une solution d’amidoschwarz et l’excès de colorant est éliminé en milieu acide. La densitométrie (à 570 nm) donne une quantification relative précise de chaque zone individualisée.

Figure 3:Automate Hydrasys® de chez Sébia (Laboratoire de Biochimie et de toxicologie, HMIMV).

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Principe de l’électrophorèse capillaire (Capillarys®)

Les protéines sont séparées dans un milieu liquide. La migration à travers un tube capillaire très fin de 20 μm, obtenue par un très haut voltage de 9000 V. Ce système permet une séparation très rapide en 7 minutes avec une excellente résolution, et évite l'inconvénient de la coloration des protéines, puisque celles-ci sont détectées directement dans le spectre ultraviolet lorsqu'elles passent devant la cellule du photomètre incorporée dans l'appareil. La sensibilité de l'électrophorèse capillaire pour la détection des composés monoclonaux (paraprotéines) est nettement augmentée par rapport aux techniques classiques. De plus, il serait théoriquement possible de séparer une centaine de protéines différentes dans le sérum; cependant le constructeur de l'appareillage a voulu garder un profil comparable à celui obtenu sur gel d'agarose, et ainsi l'aspect général de l'électrophorégramme n'est pas fondamentalement modifié. Certaines protéines, en particulier la transferrine et le complément C3 dans les β-globulines, apparaissent cependant très distinctement et ne doivent pas être prises pour des paraprotéines.

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Figure 4:Schéma de principe d’un montage d’électrophorèse capillaire.

Figure 5:Automate Capillarys® de chez Sébia (Laboratoire de Biochimie et de toxicologie, HMIMV)

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Le débit d'échantillonnage est élevé en raison du fait que le pré-traitement de l'échantillon nécessite des efforts généralement mineurs, il peut être directement injecté sans autre traitement préalable.

Initialement conçu pour l’électrophorèse capillaire des protéines sériques, les applications du Capillarys® (Sebia) se sont étendues en 2005 à l’isotypage des Igs monoclonales, à la détermination de la transferrine désialylée et à l’analyse des hémoglobines, et en avril 2012 au dosage de l’HbA1c.

Les résultats de cet examen se présentent sous la forme suivante :

- Un graphique, résultat de l’intégration par densitométrie de la bande électrophorétique ;

- Des valeurs chiffrées, pour chacune des fractions en pourcentage et en concentration (g/l calculée à partir de la protidémie totale).(figure 6) - Un commentaire issu d’une interprétation biologique comme l’exige la

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Figure 6:Normes des fractions protéiques dans le sérum (A: Capillarys,

B : Hydrasys)

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II.2.1.2.3. Quantification du pic monoclonal

Il est recommandé d’estimer la concentration du composant monoclonal par l’intégration du pic électrophorétique. En soit, la valeur de la quantification du pic n’a pas d’intérêt pronostique, mais elle est fondamentale pour l’évaluation de la réponse basée sur le pourcentage de variation du pic. La concentration initiale au diagnostic constitue la valeur de référence pour l’évaluation ultérieure de la réponse au traitement. Elle est également nécessaire pour:

 La différenciation entre MGUS et SMM

 L’évaluation du stade du myélome symptomatique (stage I, II et III : classification de Durie et Salmon)

 Pour suivre l’évolution thérapeutique d’un myélome.

 Orienter le choix de la technique d’isotypage de l’Igm (IS ou IF).

Cette technique est recommandé par les experts grâce à sa grande précision par rapport à la quantification par immunochimie (Néphélométrie ; Turbidimétrie), mais elle requiert une mesure précise de la concentration totale des protéines sériques.

Deux modes de quantifications sont à ce jour utilisés, un mode orthogonal (quantification du sommet jusqu’à la ligne de base) et un mode tangentiel (quantification uniquement au sommet du pic).

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Figure 7: Les différents modes de quantification des pics. A:mode orthogonal; B:mode tangentiel

Au sein du laboratoire de Biochimie de l’HMIMV la quantification est réalisée selon le mode orthogonal (recommandée par l’Intergroupe francophone du myélome). Ainsi, l’intégration du pic monoclonal est réalisée entre les deux points d’intersection de la courbe électrophorétique avec chacune des tangentes (figure 8).

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II.2.1.2.4. Analyses immunochimiques des immunoglobulines monoclonales : Isotypage

L’immunofixation sur Hydrasys a été introduite au sein du laboratoire de Biochimie de l’HMIMV en l’an 2000 et de ce fait a remplacé l’immunoélectrophorèse qui était utilisée auparavant pour l’identification des composants monoclonaux. L’IF est utilisée pour l’identification des Igm au niveau sérique et/ou urinaire. L’immunosoustraction sur Capillarys a été introduite en 2013, elle n’est réalisable que pour l’identification des composants monoclonaux sériques. En effet, l’IS urinaire sur Capillarys demande une étape de préparation de l’échantillon très fastidieuse et de ce fait ne peut être utilisée en routine, en plus par technique capillaire on ne dispose pas d’antisérum anti-chaînes légères libres κ et λ.

Le typage des Igs monoclonales a été réalisé soit par IF, soit par IS, pour certains patients les deux techniques ont été utilisées en parallèle.

Le choix entre les deux techniques répond aux recommandations de la société SEBIA, en effet la réalisation d’une IF est souhaitable s’il y’a présence :

• D’une hypogamma sans pic visible

• D’antécédent de gammapathie et pas de pic visible

• D’une protéine de Bence Jones dans les urines sans anomalie dans le sérum

• D’une discrète augmentation en β1 ou d’une discrète déformation en β1 ou β2

18 L’IS est réalisée s’il y’a présence :

• D’un pic ou d’une déformation en ɣ

• D’une franche augmentation en β1 ou d’une nette déformation en β1 • D’une franche augmentation ou d’une nette déformation en β2

• D’une augmentation isolée des β 2 (β2 ≥ β1) • D’une augmentation des α2

II.2.1.2.4.1. L’immunofixation sérique :

Les immunofixations sont réalisées sur des gels hydragel 2IF ou 4IF Sebia. Chaque gel contient : 8g/L d’agarose et du tampon tris-barbital, pH=8,8+/-0,1.

Dans le kit hydragel IF on trouve un coffret de fixateur et d’antisérums (contenant les Igs totales de mammifère antihumaines), les mèches, le colorant, le décolorant, des papiers filtres fin et épais, la solution de lavage et du Fluidil. Pour la réalisation des immunofixations, la migration est suivie de dépôt manuel des antisérums spécifiques.

Le principe est assez simple. Après la migration et la séparation des protéines du sérum sur un gel d’agarose (Hydragel® de Sebia) composé de 6 pistes, on applique les différents antisérums monovalents permettant de révéler : les chaînes lourdes, µ, γ, α et les chaînes légères (totales) κ et λ. Sur la première piste, qui sert de témoin d’électrophorèse, est appliquée une substance fixant les protéines par précipitation (acide sulfosalicylique). Pendant la phase d’incubation, les anticorps déposés sur le gel vont précipiter les Ig présentes. Après les étapes de lavages et de coloration, on obtient un gel sur lequel on voit apparaître la première piste de tout gel d’immunofixation qui est une piste

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témoin d’électrophorèse. Elle permet de repérer la présence d’une Igm par la mise en évidence d’une bande étroite (pic), le plus souvent dans la zone des γ-globulines, mais parfois dans la zone des β–globulines voire des α-globulines. La présence d’une Igm se traduit par une bande étroite révélée avec un antisérum anti-chaînes lourdes (anti-γ, α ou µ), associée à une bande étroite révélée avec un antisérum anti-chaînes légères (anti-κ ou λ). Toutes deux sont précipitées au même niveau de migration électrophorétique que la bande étroite présente sur la piste témoin d’électrophorèse. En cas de bande étroite révélée avec unantisérum anti-chaînes légères (anti- κ ou anti- λ), sans bande étroite avec les antisérums anti-chaînes lourdes classiques (anti-γ, α ou μ), il est nécessaire de refaire une immunofixation avant d’interpréter ce profil d’immunoprécipitation. En effet, deux antisérums complémentaires, à savoir anti- δ et anti- ε, doivent alors être utilisés. Si l’utilisation de ces deux antisérums anti- δ, et anti- ε est peu fréquente en pratique courante, elle ne doit cependant pas être oubliée. Au terme de ces deux étapes, on peut alors conclure soit à la présence d’Igm de type IgD ou IgE (bande étroite avec l’antisérum anti-δ ou ε et bande étroite avec l’antisérum anti- κ ou λ), soit à la présence de CLLM (bande étroite uniquement avec l’antisérum anti-chaînes légère). La lecture se fait à l’œil nue (figure 9) en comparant les bandes spécifiques obtenues à celles de la piste de référence.

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Figure 9:A :Exemple d’une IF sérique normale, B : IF traduisant une IgG Lambda

II.2.1.2.4.2. L’immunosoustraction sérique:

Son principe consiste à faire réagir sur l’automate Capillarys® (Sebia®), le sérum renfermant le composé monoclonal avec différentes familles de billes de sépharose sur lesquelles a été greffé un Ac réagissant contre les chaînes ɣ , α , µ, kappa ou lambda. Après agitation puis sédimentation des billes, une nouvelle électrophorèse est réalisée sur le surnageant, soumises à un champ électrique, les protéines sont séparées puis détectées par photométrie d’absorbance à 200 nm. Les profils électrophorétiques sont ensuite analysés visuellement pour détecter les anomalies et caractériser les protéines monoclonales mises en évidence.

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Figure 10:Immunotypage, technique immunotyping réalisée sur Capillarys-SEBIA.

L’analyse des résultats se fait en comparant les six électrophorégrammes de l’échantillon testé. Dans le cas normal (figure 11) on note la soustraction à 80% des IgG dont 2/3 Kappa et 1/3 Lambda, 15% d’IgA, et 5% d’IgM.

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ZOOM

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La présence d’une Igm se traduit par l’absence ou la diminution d’un pic observé avec un antisérum anti-chaînes lourdes, et l’absence ou la diminution d’un pic observé avec un antisérum anti-chaînes légères, en superposition avec l’électrophorégramme de référence.

Figure 12: Immunotypage d’un sérum présentant une Ig A lambda monoclonale migrant au niveau des bêta-2 globulines (indiquée par les flèches).

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II.2.2. Exploration Des Proteines Urinaires II.2.2.1. Phase pré-analytique :

L’échantillon urinaire destiné à l’analyse immuno-électrophorétique, environ 25 ml, doit être représentatif de la diurèse des 24 heures, car l’excrétion des chaînes légères varie au cours du nycthémère.

II.2.2.2. Phase analytique et post-analytique : II.2.2.2.1. Dosage des protéines urinaires

Le dosage de la protéinurie est réalisé par technique colorimétrique au rouge de pyrogallole sur l’ARCHITECT Ci8200.

En milieu acide, la fixation du colorant sur les groupements aminés des protéines déplace le pic d'absorption à 598 nm. Cette technique a l'avantage d'être facile à automatiser et se caractérise par une répétabilité et une reproductibilité satisfaisantes.

La protéinurie physiologique est d’environ 40 à 80 mg/24h. Une protéinurie supérieure à 150 mg/j est anormale chez l’adulte, ou 0,15 g de protéinurie/g de créatininurie. Toutefois, en 2009, la Société de néphrologie a adopté les définitions suivantes pour définir la protéinurie clinique :

• un ratio albuminurie/créatininurie supérieur à 300 mg/g ou 30 mg/mmol ;

• un ratio protéinurie/créatininurie supérieur à 500 mg/g ou 50 mg/mmol; • ou une protéinurie des 24 heures supérieure à 0,5 g.

Chez l’enfant, une protéinurie est définie chez le nouveau-né (moins de 30 jours), le nourrisson (jusqu’à 12 mois), le jeune enfant (de 2 à 10 ans) comme

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étant supérieure à 145 mg/m2/j, 110 mg/m2/j et 85 mg/m2/j respectivement. Certains utilisent néanmoins la même définition de la protéinurie chez l’enfant que celle chez l’adulte, soit une protéinurie supérieure à 150 mg/j. Les patients ayant une recherche de la protéinurie positive à deux reprises espacées de 1 à 2 semaines sont considérés comme ayant une protéinurie permanente par opposition aux protéinuries intermittentes.

II.2.2.2.2. Analyses immunochimiques des immunoglobulines monoclonales : Isotypage

II.2.2.2.2.1. L’immunofixation urinaire :

En ce qui concerne le typage d’une chaine légère libre monoclonale(CLLM), le principe est le même que pour le sérum. L’urine à analyser est déposée sans concentration préalable, dans les 6 puits constituant le gel. La première piste sert de piste témoin et les cinq autres sont mises en contact avec les antisérums suivants : un antisérum trivalent (G, A, M) réagissant avec les chaînes lourdes α , γ, μ, des 3 principales classes d’Ig, un anti-kappa libres et liées, un anti-lambda libres et liées, et enfin un anti-kappa et lambda libres

Cette technique est très sensible pour mettre en évidence et identifier la nature d’une CLLM suspectée à l’électrophorèse. Le seuil de détection se situe autour de 15 à 20 mg/L. Précisons que l’Ig typée dans le sérum permet en général de présager de la nature de l’Ig complète révélée par l’antisérum trivalent G, A, M.

Enfin, il est important de rappeler que les étapes de préparation des échantillons, notamment de dilution du sérum ou des urines en fonction du taux

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de protides totaux, sont essentielles à la bonne réalisation de la technique ainsi qu’à l’interprétation du résultat.

Figure 13: Immunofixation urinaire présentant une chaine légère monoclonal Kappa.

Il faut noter que les résultats des IF et des IS sont interprétés par au moins deux biologistes du service après discussion permettant de confronter les données cliniques et biologiques et aboutissant à un accord pour l’interprétation finale des profils.

II.2.2.2.3. Analyse et traitement des données

Les données ont été saisies et traitées par les logiciels Excel 2007.

Les résultats ont été exprimés par la moyenne ± écart-type pour les variables quantitatives et par pourcentage (effectif) pour les variables qualitatives. Ils sont reportés dans des tableaux, ou représentés sous formes d'histogrammes, de secteurs ou de barres, …

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Durant cette période de quatre ans (du 04/01/2013 au 23/12/2016), 837 demandes d’EPS ont été adressées au laboratoire et ont fait l’objet d’un isotypage. Ils sont repartis selon chaque année comme l’illustre la figure 14.

Figure 14:Répartition des demandes selon l’année