Discussion théorique
III. Caractérisation isotypique des Igm au fil du temps :
C’est une étape indispensable dans la détermination de la nature du (ou des) composant(s) monoclonal (aux) ; elle doit compléter l’électrophorèse et le dosage pondéral des Ig. Le principe général consiste en la formation de complexes Ags-Ac précipitant en milieu solide, et leur mise en évidence se fait soit de façon directe par des techniques de colorations classiques, soit de façon indirecte par un système d’immuno-soustraction.
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On cite par ordre chronologique de mise au point, les différentes techniques d’isotypage :
III.1. L’immunoélectrophorèse
Développée il y a plus de 60 ans (Grabar et Williams, 1953), l’immunoélectrophorèse combine électrophorèse en gel d’agarose et immunodiffusion (13).
Cette technique consiste en une électrophorèse en agarose, suivie d’une double diffusion contre un antisérum précipitant que l’on place dans un second temps dans une rigole parallèle à l’axe de migration. La forme et la position des arcs de précipitation sont caractéristiques de chaque protéine. La caractérisation d’une Igm se fait avec des antisérums spécifiques de chaque isotype (14).
L’immunoélectrophorèse a été largement utilisée au laboratoire durant les années 80 et début 90. Cependant, la lecture et l’interprétation des plaques étaient assez difficiles et requéraient un personnel formé et expérimenté, fondée sur la comparaison de lignes de précipitation avec une préparation témoin, le réservoir pour le dépôt d’antisérum étant disposé à égale distance de deux pistes électrophorétiques. L’analyse d’un échantillon se fait donc toujours par rapport à un témoin, appelé sérum humain normal. Avec un antisérum polyspécifique (antisérum anti-sérum humain normal obtenu chez un animal), on obtient jusqu’à 30 lignes de précipitation distinctes. La présence d’une Igm déforme la ligne de précipitation des Igs normales de même classe vers le réservoir. L’utilisation conjointe de différents antisérums monospécifiques (classiquement, antisérums anti-g, a, m, k, et l) permet de caractériser l’isotype de l’Igm : le repérage d’une ligne de précipitation déformée avec un antisérum anti-chaîne lourde (ex : antisérum anti-g), associée à une ligne de précipitation déformée
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avec un antisérum anti-chaîne légère (ex : antisérum anti-k), au même endroit de migration électrophorétique, signe la présence d’une Igm.
Figure 17:Immunoélectrophorèse : présence d’une immunoglobuline monoclonale IgG- κ (15).
Son utilisation en routine a été abandonnée en 1995 au profit de l’immunofixation (16).
III.2. L’immunosélection (17-19)
Contrairement aux autres Igs monoclonales, les molécules retrouvées au cours des maladies des chaînes lourdes ont une structure anormale : chaînes lourdes délaitées, en principe au niveau du premier domaine constant, ce qui explique leur sécrétion sans chaînes légères. Leur taux est le plus souvent faible, de l’ordre du g/L ou moins, et leur présence peut passer inaperçue à l’électrophorèse ; en raison de leur structure, ces protéines ont une grande
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hétérogénéité de charge : s’il existe une bande à l’électrophorèse, celle-ci sera plus souvent large qu’étroite, et de plus parfois de migration très rapide, notamment pour les chaînes µ. Dans le sérum l’immunoélectrophorèse met en évidence un constituant qui précipite avec un seul antisérum antichaine lourde (α, ɣ et µ par ordre de fréquence) sans réagir avec les antisérums anti-chaînes légères. Cette absence de précipitation avec les antisérums anti-κ et anti-λ n’est pas un critère suffisant, notamment pour la maladie des chaînes lourdes alpha, puisque qu’il peut parfois être difficile de mettre en évidence les chaînes légères lambda des IgA ou IgD monoclonales. Il faut avoir recours à une technique spéciale d’immunosélection combinée à l’immunoélectrophorèse ou à l’immunofixation. Cette méthode consiste à incorporer dans la gélose des antisérums antichaines légères de forte affinité afin de précipiter toutes les molécules d’Igs entières, monoclonales ou polyclonales, ne laissant plus persister que l’arc de la chaîne lourde pathologique (figure 18).
Figure 18:l’immunosélection réalisée selon la technique décrite dans la plaque du milieu (chaîne lourde gamma) (19).
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III.3. L'immuno-empreinte
La technique d'immuno-empreinte (1979) nécessite la parfaite maîtrise du western-blot. Elle est plus sensible (15) que l'immuno-électrophorèse et que l'immunofixation grâce à la révélation immuno-enzymatique des Igs, condition adaptée à l'étude des urines ou du liquide céphalo-rachidien sans concentration préalable. Elle présente également l'avantage d'appliquer l'utilisation d'Ac non précipitants, tels que les Ac monoclonaux, d'éviter les phénomènes de zone, d'être réversible et ainsi de permettre plusieurs typages sur une même membrane. Son inconvénient est d'être peu discriminante sur des sérums totaux où les bandes sont difficiles à distinguer sur le fond polyclonal.
Figure 19:Schéma illustrant le principe de la technique Western Blot
La présence d’une Igm se traduit par une bande étroite révélée avec un antisérum anti-chaînes lourdes et une bande étroite révélée avec un antisérum anti-chaînes légères (figure 20).Cette technique ne comporte pas de risque de résultat faussement négatif lié au phénomène de zone. Son principe permet l’utilisation d’Ac non précipitants, donc d’Ac monoclonaux(10).
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Figure 20:Recherche d’immunoglobuline monoclonale par immuno-empreinte.
III.4. L’immunofixation
Similaire à l'immunoélectrophorèse (IEP) en principe, mais au lieu de laisser l'Ag et l'Ac diffuser dans le milieu de support, les antisérums sont appliqués, après électrophorèse, à la surface du milieu. La formation d'une immunoprécipitine avec un antisérum monospécifique identifie la protéine d'intérêt. Ce concept de base a été décrit pour la première fois par Afonso en 1964, mais ce n'était pas une technique pratique qu’après modification en 1969 par Alper et Johnson(20).
Cette technique est largement utilisée actuellement dans les laboratoires pour différentes raisons : elle est plus rapide (1 à 2 heures), elle est en partie automatisable, l’interprétation des résultats est plus aisée, elle offre une meilleure sensibilité (seuil de détection à 0.20 g/L) que l’immunoélectrophorèse (21), et enfin elle permet de caractériser plusieurs Igms (profils oligoclonaux) de spécificité de chaînes lourdes ou légères différente migrant au même niveau.
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III.5. L’immunosoustraction:
La dernière et plus récente technique mise en routine pour typer une Igm, est l’immunosoustraction. Cette technique s’est développée grâce à l’émergence de l’électrophorèse capillaire qui est son support direct. Deux méthodologies existent. La première, celle de Beckman, sur l’automate Paragon CZE 2000® qui utilise des billes de sépharose sur lesquelles sont fixés des Ac spécifiques réagissant respectivement avec les chaînes lourdes , µ, α , γ et les chaînes légères κ , λ ; un puits sert de référence. Les complexes Ags-Ac précipitent alors au font des puits par sédimentation, c’est l’immunosoustraction. Les surnageants sont ensuite prélevés et injectés dans les capillaires où a lieu l’étape classique de séparation électrophorétique (22). La deuxième technique d’immunosoustraction a été développée par la société SEBIA en 2005 (23) sur le Capillarys®.