Phasage de la structure 6His-HpDnaB par single anomalous dispersion

Afin de résoudre le problème de phase, les cristaux de 6His-HpDnaB ont été trempés avec du bromure de tantalate (Ta6Br12²⁺) pour que l’atome lourd diffuse à l’intérieur du cristal. Après deux heures de trempage, le bromure de tantalate avait pénétré les cristaux qui avaient pris une couleur verte. Les cristaux ont été cryoprotégés en utilisant la solution de cristallisation complémentée avec 10% (v/v) de sucrose saturé puis congelés dans l’azote liquide (Figure 49).

Figure 49 : Cristal de 6His-HpDnaB trempé avec du Ta6Br12.²⁺. La photo a été prise sur la ligne de lumière Proxima 2a du synchrotron SOLEIL.

124 La première étape était de vérifier la présence de l’atome lourd dans les cristaux. Pour cela, une expérience de fluorescence a été réalisée sur la ligne de lumière Proxima 2a au synchrotron SOLEIL. Le spectre indique un pic d’absorption à l’énergie (E = 9982 eV), proche du seuil théorique du tantalate (9881 eV). A partir du spectre, nous avons ainsi pu déterminer l’énergie correspondant au pic et au point d’inflection du tantalate (Figure 50).

Figure 50 : Spectre de fluorescence réalisé sur la ligne de lumière Proxima 2a (en haut). Estimation des valeurs de f’’ (bleu) et f’ (rouge) (en bas)

Nous avons ensuite enregistré deux jeux de données : Tant 1 et Tant 2. Nous avons utilisé la méthode de collection inversée (« inversed beam »). Cette technique a pour objectif d’optimiser l’enregistrement du signal anomal. En collectant alternativement 10 images sur un angle puis à 180°, elle permet d’éviter des dégâts d’irradiation pouvant subvenir lors de la collection qui dégradent la qualité du jeu de données. On obtient ainsi des jeux de données isomorphes qu’il est possible de combiner, permettant ainsi d’augmenter la quantité de signal anomal (Tableau 6). Les jeux Tant 1 et Tant 2 ainsi obtenus ont été collectés sur le même cristal mais en exposant deux endroits du cristal et en augmentant le temps d’exposition de 30% pour Tant 2.

125 L’indexation et l’intégration des jeux de données ont été réalisées avec le programme XDS (Kabsch, 1993) qui a identifié le groupe d’espace le plus probable comme étant I213. Le logiciel POINTLESS (Evans, 2011) a également évalué que ce même groupe d’espace était le plus probable. Les paramètres de maille sont presque identiques à ceux des cristaux natifs : a = b = c = 284,03 ; α = β = γ = 90°. La résolution des jeux de données a été estimée grâce au facteur R mais surtout grâce au facteur CC1/2. Le facteur CC1/2 est un coefficient calculé à partir du pourcentage de corrélation entre deux intensités (I1 et I2) sélectionnées de façon aléatoire à l’intérieur d’un même jeu de données : CC1/2= Corrélation (I1, I2) (Diederichs & Karplus, 2013 ; Karplus & Diederichs, 2012). En ce qui concerne Tant1, nous avons limité la résolution à 7,5 Å pour obtenir des phases de meilleure qualité avec un rapport signal sur bruit (I/σ(I)) supérieur à 2,5. Pour Tant 2, nous avons conservé le maximum de réflexions possible, tout en conservant un rapport I/σ(I) supérieur à 1. Le tableau de statistiques finales des deux jeux de données est présenté ci-dessous (Tableau 6).

Jeu de données Tant 1 (Ta6Br12²⁺) Tant 2 (Ta6Br12²⁺) SOLEIL-Proxima2a SOLEIL-Proxima2a

Longueur d’onde (Å) 1,2546 1,2546

Groupe d’espace I213 I213

Paramètres de la maille (Å, °) a = b = c = 284,03 ; β = 90 a = b = c = 283,47 ; β = 90 Limite de résolution (Å) 48,8-7,5 (7,91-7,50) 47,2 - 6,7 (6,93 - 6,70) Nombre total de réflexions 171283 (25533) 308609 (45815)

Nombre de réflexions uniques 5016 (725) 6954 (1005)

Complétude (%) 99,6 (100) 99,7 (100) Complétude anomale (%) 99,7(100) 99,8 (100) Redondance 34,1 (35,2) 44,3 (45,6) Redondance anomale 18,1(18,2) Rmeas 0,13 (>1) 0,18 (>1) Rpim 0,03 (0,27) 0,03 (0,99) Rmerge 0,11 (>1) 0,17 (>1) CC1/2 99,9 (78,9) 99,9 (41,6) I/σ(I) 27,6 (2,8) 18,3 (1,2) Facteur B moyen (Å2) 334 502

Tableau 6 : Statistiques des données de diffraction des deux jeux Tant 1 et Tant 2. Les valeurs entre parenthèses correspondent aux statistiques de la dernière coquille de résolution.

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3.2.4.1. Localisation des sites, phasage et amélioration de la carte de densité électronique

Le principe d’un phasage par SAD est de localiser la position des atomes lourds en utilisant le signal anomal afin de déterminer les phases. Nous avons utilisé le jeu de données Tant 1 et déterminé la position des groupes d’atomes de bromure de tantalate grâce au programme Autosolve du logiciel PHENIX (Adams et al., 2010). Les valeurs de f’ et f’’ ont été utilisées dans le logiciel HYSS (McCoy et al., 2004) pour déterminer la position des atomes lourds. Le logiciel a trouvé la position de trois groupes d’atomes. Leurs coordonnées ont ensuite été utilisées dans Phaser (McCoy et al., 2007) intégré dans le programme Resolve de PHENIX (Adams et al., 2010 ; Terwilliger et al., 2000) pour l’affinement des coordonnées et de l’occupation. La méthode SAD conduit à une ambiguïté sur la position des atomes lourds car elle ne permet pas de faire la distinction entre les deux « mains » possible du cristal. Deux solutions sont possibles, une position dans le groupe d’espace dans lequel nous avons intégré les données et une position dans un groupe différent mais indistinguables au niveau des réflexions présentes (dans notre cas I23 ou I213). Le logiciel effectue une modification de densité dans les deux groupes d’espace. On obtient donc deux cartes de densité électronique expérimentales correspondant à la tentative de phasage dans les deux groupes d’espaces après modification de densité. L’examen visuel des cartes indiquait clairement que le bon groupe d’espace était I213 (Tableau 7). Après modification de densité, la carte électronique obtenue est de très bonne qualité et permet de voir la densité électronique de la protéine (Figure 51).

Statistiques de phasage

Nombre de sites de Ta6Br12²⁺ trouvés 3 Figure de mérite (FOM) avant modification

de densité 0,36

Figure de mérite (FOM) après modification

de densité 0,78

127 La carte de densité électronique obtenue à 7,5 Å de résolution révèle que l’unité asymétrique est composée de quatre monomères. On voit très clairement que HpDnaB forme des dodécamères générés par l’axe cristallographique de symétrie trois (Figure 51). L’assemblage est constitué de deux hexamères qui se font face par l’anneau NTD dans le cristal. Dans l’unité asymétrique les quatre monomères sont répartis en deux dimères (un pour chaque hexamère) qui se font face. Avec quatre monomères dans l’unité asymétrique, le calcul du pourcentage de solvant grâce au coefficient de Matthews, estime à 70% le taux de solvant dans le cristal. Un taux aussi élevé est beaucoup pour un cristal d’une macromolécule biologique. En général, les cristaux de protéines, contiennent environ 50% de solvant. Nous avons pu ensuite étendre les phases à 6,7 Å de résolution grâce au jeu de donnée Tant 2 et débuter l’affinement.

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Figure 51 : Carte de densité électronique obtenue après phasage par Autosolve. (A) Densité électronique du dodécamère. Vue selon l’axe de symétrie trois, (B) densité électronique correspondant à l’anneau NTD et (C) densité

électronique correspondant à l’anneau CTD.