Expressions et purifications des protéines étudiées

Une préculture de 20 ml de LB inoculée avec la souche bactérienne BL21* portant le plasmide pET151-6His-HpDnaB est réalisé à 37°C pendant 16h. Un litre de culture LB dans des flasques de 2 litres à encoche est inoculé avec la préculture et les cellules sont placées à 37°C sous agitation jusqu’à une valeur de DO600=0,6 (ces étapes seront identiques pour toutes les productions de protéines). La température est diminuée à 20°C et l’expression de la protéine est induite par l’ajout d’IPTG dans le milieu toute une nuit. Les cellules sont centrifugées à 6000 g (JLA-9.100 rotor, Beckman Coulter) pendant 20 min et le culot est resuspendu dans 25 mL de tampon de lyse (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 200 mM NaCl) avec une tablette d’anti-protéase par litre de culture (complete EDTA-free, Roche), du lysozyme (Roche) et de la DNAse (Sigma-Aldrich). Les cellules sont lysées par trois sonications de 3 min et centrifugées à 16000 g à 4°C pour retirer les débris cellulaires. La fraction soluble est chargée sur une colonne HisTrapTM HP de 5 mL (GE Healthcare) équilibrée au préalable avec du tampon A (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 200 mM NaCl, 2 mM β-mercaptoéthanol). Après avoir chargé la fraction soluble, la colonne est lavée avec 50 ml de tampon A. Un second lavage est réalisé avec 10 ml de tampon A + 1 M NaCl afin d’éliminer l’ADN contaminant. Une première élution est ensuite effectuée avec 10% de tampon B (10 mM phosphate de sodium pH 7,5 ; 200 mM NaCl ; 2 mM β-mercaptoéthanol et 500 mM imidazole). Cette première élution permet de retirer une partie des contaminants

75 protéiques ayant une faible affinité voir une affinité aspécifique pour la colonne. L’élution se poursuit avec un gradient allant de 10% à 100% de tampon B. Les différentes fractions des étapes de purification sont analysées sur gel de polyacrylamide SDS 15% (ceci est valable pour l’ensemble des purifications). Les fractions contenant la protéine la plus pure possible sont ensuite rassemblées. La protéine est concentrée par centrifugation sur une unité de filtration amicon de 30 kDa (Milipore) et injectée sur une colonne d’exclusion stérique Superdex 200 10/300GL en utilisant un tampon composé de 10 mM phosphate de sodium pH 7,5 ; 150 mM NaCl ; 2 mM β-mercaptoéthanol. Les fractions éluées contenant la protéine pure sont rassemblées et concentrées jusqu’à 10 mg/mL.

2.2.3.2. Expression et purification de HpDnaB

Les cellules sont incubées à 37°C sous agitation jusqu’à une valeur de DO600=0,6. La température est diminuée à 20°C et l’expression de la protéine est induite par l’ajout d’IPTG toute la nuit. Les cellules sont centrifugées à 6000 g pendant 20 min et le culot est resuspendu dans 25 mL de tampon de lyse (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 200 mM) avec une tablette d’anti-protéase par litre de culture (complete EDTA-free, Roche), du lysozyme (Roche) et de la DNAse (Sigma-Aldrich). Les cellules sont lysées par trois sonications de 3 min et centrifugées de nouveau à 16000 g à 4°C (JA-20 rotor, Beckman Coulter) pour retirer les débris cellulaires. La fraction soluble est diluée pour atteindre une concentration de NaCl égale à 50 mM. Cette solution est ensuite chargée sur une colonne HiTrap Héparine HP de 5 mL (GE Healthcare) équilibrée au préalable avec du tampon A (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 2 mM β-mercaptoéthanol). Après avoir chargé la fraction soluble, la colonne est lavée avec 50 ml de tampon A. Une première élution est effectuée avec 10% de tampon B (10 mM phosphate de sodium pH 7,5 ; 2 mM βME ; 1 M NaCl). Cette première élution permet de retirer une partie des contaminants protéiques ayant une faible affinité pour la colonne. L’élution se poursuit avec un gradient allant de 10% à 100% de tampon B. Les fractions contenant la protéine sont ensuite concentrées par centrifugation dans une unité de filtration amicon de 30 kDa (Milipore). La concentration en NaCl du tampon est diluée à 50 mM avec du tampon A et la protéine est injectée sur une colonne d’affinité échangeuse d’anions HiTrap Q HP. La colonne est lavée avec 50 mL de tampon A et la protéine est éluée avec un gradient allant de 10% à 100% de tampon B. Les fractions contenant la protéine pure sont rassemblées

76 et dialysées contre du tampon A + 150 mM NaCl. La protéine est ensuite concentrée par centrifugation jusqu’à 10 mg/mL.

2.2.3.3. Purification de HpDnaGHBD

Les cellules ont été cultivées à 37°C jusqu’à une DO600=0,6. L’expression de la protéine a été induite par l’ajout d’IPTG dans les cultures. Les cellules ont ensuite été placées à 20°C sous agitation toute une nuit. Les cellules ont été centrifugées à 6000 g pendant 20 min et resuspendues dans 25 mL de tampon de lyse (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 5% glycérol) avec une tablette anti-protéase (Roche), du lysozyme (Roche) et de la DNAse (Sigma-Aldrich). Les cellules ont été lysées par trois sonications de 3 min et centrifugées à 16000 g pendant 20 min (JA-20 rotor, Beckman Coulter). La fraction soluble est chargée sur une colonne HisTrap Hp 5 mL pré-équilibrée par du tampon A (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 5% glycérol). La colonne est ensuite lavée avec dix volumes colonne de tampon A. Un second lavage est effectué avec du tampon A +1 M NaCl afin d’éliminer l’excès d’ADN. Les premiers contaminants sont élués avec un lavage à 10% de tampon B (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycérol et 500 mM Imidazole) suivi d’un gradient d’élution de 10 à 100% de tampon B. Les différentes étapes de la purification sont analysées sur gel polyacrylamide SDS 15%. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et l’étiquette histidine est clivée par l’ajout de Tobacco Etch Virus (TEV) protéase en présence de 0,5 mM EDTA, puis placées en dialyse contre le tampon A toute la nuit. La dialysat est chargé sur la colonne HisTrap 5 mL pour séparer la protéine de la TEV protéase.

2.2.3.4. Co-expression et purification du complexe HpDnaByyHpDnaGHBD

Pour produire le complexe, les plasmides pACYC-HpDnaB (résistant au chloramphénicol) et pET151-HpDnaGHBD (résistant à l’ampicilline) ont été introduits en même temps dans des cellules BL21* par choc thermique en suivant le même protocole que pour les plasmides seuls. Après inoculation de la préculture, les cellules ont été cultivées à 37°C jusqu’à une DO600=0,6. L’expression du complexe est induite par l’ajout d’IPTG. La température est ensuite diminuée à 20°C et les cellules sont placées sous agitation toute la nuit. Celles-ci sont ensuite centrifugées 20 min à 6000 g et resuspendues dans 25 mL de tampon de lyse (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl) avec une tablette anti-protéase (Roche), du lysozyme (Roche) et de la DNAse (Sigma-Aldrich). Les cellules sont lysées par trois

77 sonications de 3 min et centrifugées 20 min à 16000 g. Le surnageant est ensuite chargé sur une colonne HisTrap Hp 5 mL (GE Healthcare) pré-équilibrée avec du tampon A (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycérol). La colonne est lavée avec 50 mL de tampon A puis avec 10 mL de tampon A + 1 M de NaCl (pour éliminer l’ADN). On effectue ensuite une première élution avec 10% de tampon B (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycérol et 500 mM Imidazole) pour retirer les contaminants aspécifiques, suivi d’un gradient d’élution de 10% à 100%.

2.2.3.5. Expression et purification de 6His-HpDnaB-Se

Une préculture de 20 mL de LB + chloramphénicol est inoculée avec une colonie ou un stock glycérol et placée à 37°C toute la nuit sous agitation. Ces 20 mL de culture en LB sont ensuite ajoutés à 1 litre de milieu M9 fraichement préparé (voir 2.1.2) et placé à 37°C sous agitation jusqu’à une DO600=0,6. On ajoute 50 mg de Thréonine, 50 mg de Lysine, 50 mg de Phenylalanine, 50 mg de Leucine, 25 mg d’Isoleucine, 25 mg de Valine (Sigma-Aldrich) et 4 mL de Séléno-méthionine liquide (Molecular Dimensions) dans la culture. Après 15 min d’incubation à 37°C, l’expression de la protéine est induite par l’ajout d’IPTG. Les cellules sont enfin placées à 20°C sous agitation toute la nuit. Les cellules sont centrifugées 20 min à 6000 g et le culot est resuspendu dans 25 mL de tampon de lyse (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM βME). La culture est congelée à -80°C. Pour la purification, la culture est décongelée et une tablette anti-protéase, du lysozyme et de la DNAse sont ajoutés. Les cellules sont lysées par trois sonications de 3 min et centrifugées 20 min à 16000 g. Le surnageant est chargé sur une colonne HisTrap Hp 5 mL et la colonne est lavée avec 50 mL de tampon A (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM βME) jusqu’à ce que l’absorbance UV revienne à la ligne de base. On effectue un premier lavage avec 10% de tampon B (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM βME et 500 mM Imidazole) suivi d’un gradient d’élution de 10% à 100%. Les fractions sont ensuite déposées sur un gel polyacrylamide SDS 15%. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées puis concentrées par centrifugation pour ensuite être injectées sur une colonne d’exclusion stérique Superdex 200 10/300GL (10 mM phosphate de sodium pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM βME). La protéine éluée est concentrée par centrifugation sur une unité de filtration amicon de 30 kDa (Millipore) jusqu’à une concentration finale d’environ 10 mg/mL.

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2.2.3.6. Purification de HpDnaA

Les cellules sont cultivées à 37°C jusqu’à une DO600=0,6 puis l’expression de HpDnaA est induite par l’ajout d’IPTG. Les cellules sont ensuite placées à 20°C toute la nuit. Les cultures sont centrifugées 20 min à 6000 g et le culot bactérien est repris dans 30 mL de tampon de lyse (45 mM Hepes pH 7,5, 300 mM NaCl, 100 mM de Monopotassium L-glutamate monohydrate, 10% glycérol, 5% Sucrose, 1% Tween, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2). Les cellules sont congelées à -80°C et décongelées pour la purification. On ajoute une tablette anti-protéase par litre de culture, du lysozyme et de la DNAse. Les cellules sont lysées par trois sonications de 3 min et centrifugées 15 min à 16000 g. Le surnageant est ensuite chargé sur une colonne HisTrap HP 5 mL (GE Healthcare) pré-équilibrée avec du tampon A (45 mM Hepes pH 7,5, 10 mM d’acétate de magnésium, 100 mM de Monopotassium L-glutamate monohydrate, 1 mM DTT, 10% sucrose). La colonne est lavée avec 50 mL de tampon A. Un lavage avec 10% de tampon B (45 mM Hepes pH 7,5, 10 mM d’acétate de magnésium, 100 mM de Monopotassium L-glutamate monohydrate, 1 mM DTT, 10% sucrose, 500 mM Imidazole) élue HpDnaA. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et chargées sur une colonne d’héparine pré-équilibrée avec du tampon C (45 mM Hepes pH 7, 10 mM d’acétate de magnésium, 1 mM DTT et 100 mM de monopotassium L-glutamate monohydrate). La colonne est lavée avec 50mL de tampon C. La protéine est éluée avec un gradient de tampon D (45 mM Hepes pH 7, 10 mM d’acétate de magnésium, 1 mM DTT et 100 mM de monopotassium L-glutamate monohydrate, 1 M NaCl). Les fractions contenant la protéine sont rassemblées, le NaCl est dilué jusqu’à 50 mM avec le tampon C. La solution est ensuite chargée sur une colonne échangeuse d’anions (MonoQ GE Healthcare). La protéine ne s’attache pas à la colonne et est éluée dans la fraction non retenue qui est ensuite dialysée contre du tampon C avec 150 mM NaCl. La protéine est concentrée jusqu’à 5 mg/mL et 20% de glycérol (concentration finale) est ajouté avant de congeler la protéine à -80°C.

2.2.3.7. Purification de HU

Le plasmide pET151 contenant le gène codant pour HU était déjà disponible à mon arrivée au laboratoire. Les bactéries BL21 portant le vecteur ont été cultivées à 37°C dans du LB + ampicilline sous agitation jusqu’à une DO600 = 0,6. L’expression de la protéine a ensuite été induite par l’ajout d’IPTG dans la culture, les bactéries ont ensuite été placées à 20°C sous agitation toute la nuit. Les bactéries sont centrifugées 20 min à 6000 g et le culot est repris

79 dans 25 mL de tampon de lyse (40 mM Tris pH 8, 250 mM NaCl, 5% glycérol). Le culot est ensuite congelé à -80°C. Pour la purification, une tablette anti-protéase (Roche), du lysozyme (Roche) et de la DNAse (Sigma-Aldrich) sont rajoutés et les bactéries sont lysées par trois sonications de 3 min. Les cellules sont centrifugées pendant 20 min à 16000 g et le surnageant est injecté sur une colonne HisTrap Hp 5 mL pré-équilibrée avec du tampon A (45 mM Tris pH 8, 250 mM NaCl et 5% glycérol). La colonne est lavée avec 50 mL de tampon A. Un second lavage est effectué avec 10 mL de tampon A + 1 M NaCl pour éliminer l’ADN contaminant. Un second lavage est réalisé avec 10% de tampon B (40 mM Tris pH 8, 250 mM NaCl, 5% glycérol et 500 mM Imidazole). La protéine est éluée par un gradient de 10% à 100% de tampon B. Les fractions contenant la protéine la pure sont rassemblées et l’étiquette histidine est coupée par la protéase TEV. Pour cela, on ajoute 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA, la protéase TEV, et les fractions sont dialysées dans du tampon A à 4°C toute la nuit. Le dialysat est chargé une nouvelle fois sur la colonne HisTrap Hp 5 mL sur laquelle la protéine clivée n’est pas retenue. La protéine éluée est concentrée à 10 mg/mL et conservée à -80°C.

2.2.3.8. Purification de HpDnaBNTD

Pour produire la protéine, les bactéries sont mises en culture dans du LB contenant de l’ampicilline à 37°C sous agitation jusqu’à une DO600=0,6. L’expression de la protéine est induite par l’ajout d’IPTG et les bactéries sont placées à 20°C sous agitation toute la nuit. Les cellules sont centrifugées 20 min à 6000 g et le culot est repris dans 25 mL de tampon de lyse (50 mM Tris pH 8, 300 mM NaCl, 1 mM Imidazole). Les bactéries sont ensuite congelées à -80°C. Pour la purification, une tablette anti-protéase est ajoutée par litre de culture avec du lysozyme et de la DNAse et les cellules sont lysées par trois sonications de 3 min. Elles sont ensuite centrifugées 20 min à 16000 g. Le surnageant est injecté sur une colonne HisTrap Hp 5 mL équilibrée avec du tampon A (50 mM Tris pH 8, 300 mM NaCl, 1 mM Imidazole). La colonne est lavée avec 50 mL de tampon A. L’excès d’ADN est élué avec un lavage de 10 mL de tampon A + 1 M NaCl. On effectue une première élution avec 10% de tampon B (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 300 mM Imidazole) pour éliminer les contaminants liés de manière aspécifique. La protéine est éluée avec du tampon B et les fractions contenant la protéine sont rassemblées. La concentration en NaCl est diminuée à 50 mM avec du tampon A’ (50 mM Tris pH 8, 5% glycérol et 1 mM DTT). La protéine est injectée sur une colonne échangeuse d’anions équilibrée en tampon A’. La colonne est lavée avec 50 mL de tampon A’ puis la

80 protéine est éluée avec un gradient de tampon B (50 mM Tris pH 8, 5% glycérol et 1 mM DTT 1 M NaCl). Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et concentrées par centrifugation jusqu’à 10 mg/mL.