Cristallisation des protéines

La cristallographie aux rayons X est la technique la plus utilisée pour résoudre la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques. La résolution d’une structure de protéine nécessite trois étapes : 1) la surproduction et la purification de la protéine d’intérêt pour qu’elle soit la plus pure possible et en quantité suffisante. 2) l’obtention de cristaux de cette protéine (ou cristallogenèse) possèdant une bonne qualité de diffraction. 3) La résolution de la structure de la protéine, c’est-à-dire résoudre le problème de phase inhérent à la cristallographie aux rayons X.

2.3.1.1. Paramètres influençant la cristallogenèse

La cristallisation d’une protéine est une transition de phase : elle nécessite de faire passer une protéine d’un état liquide vers un état solide organisé. Cette transition de phase est réalisée en faisant varier un ou plusieurs paramètres physico-chimiques. Ces paramètres sont variables d’une protéine à une autre et sont principalement :

x La nature et la concentration de l’agent précipitant : o Les polymères

o Les sels

o Les solvants organiques x La nature et le pH du tampon

x La nature et la concentration d’un additif x La température

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2.3.1.2. Diagramme de phase

La variation de la concentration de l’agent précipitant en fonction de la concentration de la protéine à cristalliser va jouer un rôle critique dans la cristallogenèse qui peut être résumée par un diagramme de phase (Figure 27). Celui-ci met en évidence l’existence de plusieurs zones :

x La zone de solubilité (sous-saturation) dans laquelle la protéine reste soluble et dans laquelle aucun cristal ne pourra apparaître.

La zone de solubilité est délimitée par la courbe de solubilité qui représente la limite entre la phase soluble et la phase solide (cristal, précipité microcristallin ou amorphe).

x La zone de sursaturation qui est divisée en une zone de précipitation et une zone métastable.

o La zone de précipitation : dans cette zone, la protéine n’est plus soluble. Elle se trouve alors dans un état de sursaturation qui lui permet d’initier la cristallisation : c’est le phénomène de nucléation. La nucléation revient à déstabiliser les interactions solvant au profit d’interactions protéines-protéines. Des interactions protéines-protéines non spécifiques amènent à la précipitation (phase solide amorphe) alors que des interactions spécifiques amènent à la formation de germes cristallins.

o La zone métastable : dans cette zone la sursaturation plus faible permet la croissance cristalline. Le cristal croît et la concentration en protéine diminue jusqu’à atteindre la courbe de solubilité : condition d’équilibre où un cristal ajouté à la solution ne pourra ni croître ni se dissoudre.

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Figure 27 : Diagramme de phase pour la cristallisation d’une protéine

2.3.1.3. Méthodes de cristallogenèse utilisées

La méthode de cristallisation utilisée pendant cette thèse est celle de la diffusion de vapeur (Wlodawer et Hodgson, 1975 ; McPherson et al., 1995) en gouttes suspendues ou en gouttes assises (Figure 28). Dans le cas de la goutte suspendue, le principe est de réaliser une goutte contenant la solution protéique et la solution de cristallisation (contenant l’agent cristallisant, les sels, etc…). On mélange généralement 1 μL de solution de cristallisation à 1 μL de solution protéique pour former la goutte sur une lamelle siliconée (pour éviter que la goutte ne s’étale). Cette lamelle est ensuite retournée au-dessus d’un réservoir contenant 500 μL de la solution de cristallisation. L’ensemble est scellé grâce à de la graisse. La solution de cristallisation dans la goutte étant diluée par la solution protéique, sa concentration est plus faible que dans le réservoir. La vapeur d’eau va alors diffuser (d’où le nom de diffusion de vapeur) jusqu’à ce que la concentration de l’agent précipitant soit la même entre la goutte et le réservoir. Le volume du réservoir étant très supérieur à celui de la goutte, le volume de cette dernière va diminuer et la concentration de la solution de cristallisation augmenter pour tendre vers celle du réservoir. La diminution du volume de la goutte provoque l’augmentation de la concentration de la protéine et de la solution de cristallisation pouvant amener à un état de sursaturation et donc de nucléation. Dans le cas de la goutte assise, le principe est le même à la différence que la goutte est déposée sur un socle dans le réservoir qui est ensuite fermé hermétiquement par un film collant. Les gouttes assises peuvent être effectuées manuellement

83 ou à l’aide d’un robot de cristallisation, qui permet de cribler plus rapidement un grand nombre de conditions et ce avec une faible quantité de protéine.

Figure 28 : Schéma du principe de la diffusion de vapeur. (A) Technique de la goutte suspendue. (B) Technique de la goutte assise.

2.3.1.4. Cryo-protection des cristaux

L’un des problèmes de la cristallographie des protéines est l’exposition aux rayons X lors de l’enregistrement des données de diffraction. Les rayons X génèrent des radicaux libres qui endommagent les molécules du cristal, entrainant une diminution progressive de la qualité de diffraction. Pour limiter le plus possible ce phénomène, la solution est de congeler les cristaux afin de limiter au maximum la diffusion des radicaux libres. Les cristaux sont prélevés individuellement à l’aide d’une boucle et refroidis rapidement à une température inférieure à 100 K par immersion dans de l’azote liquide. Pour éviter la formation de glace lors de la congélation, il est nécessaire d’utiliser un cryo-protectant. En effet, si on refroidit le cristal uniquement en présence de sa solution de cristallisation, l’eau contenue dans le cristal formera de la glace et détruira l’organisation cristalline. L’utilisation d’un cryo-protectant permet une vitrification de l’eau du cristal et évite la formation de cristaux de glace. La manière dont on utilise le cryo-protectant est empirique et varie d’un cristal à un autre. Le cryo-protectant peut être directement introduit dans la goutte mais cela peut créer un déséquilibre dans les concentrations des agents cristallisant pouvant entraîner une cassure et/ou une dissolution totale du cristal. Une autre méthode est de transférer au préalable le cristal dans une goutte contenant la solution de cristallisation avec du cryo-protectant. Pour éviter un écart brutal de concentration les cristaux sont transférés successivement dans plusieurs gouttes ayant une concentration croissante en cryo-protectant. La concentration finale en cryo-protectant est elle aussi variable d’une protéine à une autre. Dans notre cas, la

84 solution de cristallisation de 6His-HpDnaB a été modifiée par l’ajout de 10% (v/v) de sucrose comme cryo-protectant.