1. 1. 1.
1. Couplage CE Couplage CE Couplage CE Couplage CE----ESI ESI ESI ESI----MS pour l’analyse de composés MS pour l’analyse de composés MS pour l’analyse de composés MS pour l’analyse de composés pharmaceutiques dans les fluides biologiques
pharmaceutiques dans les fluides biologiques pharmaceutiques dans les fluides biologiques pharmaceutiques dans les fluides biologiques
L’article II article II article II article II présente deux procédures CE-ESI-MS avec simple quadripôle pour l’analyse stéréosélective de composés d’intérêt pharmaceutique dans le plasma. Le développement de ces méthodes est basé sur les deux principaux objectifs de la bioanalyse, i.e., le temps vs. la sensibilité. Les efforts se sont tournés vers la préparation d’échantillon et le mode d’injection comme approches privilégiant l’un ou l’autre des objectifs. Les effets de matrice ont également été étudiés puisqu’ils peuvent être à l’origine de suppression de signal en ESI-MS et potentiellement compromettre la quantification des analytes. Cette dernière est abordée dans l’article III article III article III qui présente la méthodologie employée et les résultats obtenus lors de article III l’évaluation des performances quantitatives des méthodes précédemment développées. Finalement, celles-ci ont été appliquées au dosage de cas réels issus de toxicologie.
Lors de ce travail, des dérivés amphétaminiques (i.e., amphétamine, (A), méthamphétamine (MA), méthylènedioxyamphétamine (MDA), méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA) et méthylènedioxyéthylamphétamine (MDEA)) ont été analysés car ils présentent un intérêt particulier dans le domaine de la toxicologie1, dû à leur accessibilité facilitée sur le marché alternatif par des prix très attractifs (ca. 10 CHF le comprimé)2. En matière de toxicologie, le tramadol (TMD) et la méthadone (MTD) occupent aussi une place importance, ils ont donc été ajoutés au cocktail de médicaments. Il est à noter que toutes ces molécules possèdent un carbone asymétrique et que leurs propriétés pharmacologiques diffèrent en fonction de l’énantiomère considéré3. Le métabolisme de certains composés est en outre stéréosélectif (e.g. méthadone) et des variations interindividuelles peuvent alors induire des modifications des taux4;5. Il paraît donc important de pouvoir doser chaque énantiomère dans les fluides biologiques.
Chapitre 2 Chapitre 2 Chapitre 2
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1.1.1.
1.111.... Préparation d’échantillon1 Préparation d’échantillonPréparation d’échantillonPréparation d’échantillon
L’analyse de produits dans une matrice complexe implique forcément une procédure de préparation d’échantillon afin de (i) stabiliser l’échantillon (reconstitution dans un solvant approprié), (ii) augmenter la sélectivité (élimination des interférents endogènes), (iii) empêcher la contamination de l’instrument par ces interférents, et éventuellement (iv) pré-concentrer l’analyte (amélioration de la sensibilité). De nombreuses procédures de préparation de l’échantillon existent, notamment l’extraction liquide-liquide (LLE), l’extraction sur phase solide (SPE), la microextraction en phase solide (SPME), la précipitation des protéines (PP), etc. Ces dernières diffèrent selon plusieurs critères : (i) la durée, (ii) la sensibilité (i.e., le niveau de pré-concentration), (iii) la sélectivité, (iv) l’automatisation, (v) le coût, et (vi) le volume d’échantillon nécessaire. Dans ce travail, les composés sont présents dans une matrice plasmatique, les interférents majeurs sont donc des protéines qui peuvent nuire au processus électrophorétique comme à l’ionisation par électrospray et la détection MS. Comme l’objectif implique soit un temps de préparation court, soit une procédure nivelante permettant une sensibilité élevée, une précipitation des protéines a été choisie pour atteindre le premier objectif tandis qu’une extraction liquide-liquide a permis d’achever le second.
1.1.1. Précipitation des protéines (PP)
La PP consiste en une dénaturation des protéines contenues dans les échantillons sanguins grâce à l’addition d’un réactif qui modifie leurs propriétés physico-chimiques (e.g. l’ajout d’acétonitrile induit la modification de la constante diélectrique de la solution, entraînant de nouvelles interactions électrostatiques et la formation d’un aggrégat protéique). La PP est une technique simple et rapide à mettre en œuvre (ca. <10 min.) : une fois le réactif ajouté, l’échantillon est centrifugé et le surnageant directement injecté dans le système électrophorétique6;7. Il faut noter cependant que la PP est une technique peu sélective. En effet, 5 à 10 % du matériel protéique est encore présent dans le surnageant après précipitation et d’autres composés endogènes (e.g. lipides, sels) ne sont pas éliminés par ce biais et peuvent interférer avec le système analytique8;9. Différentes techniques de PP
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existent et se distinguent principalement par le réactif employé, qui peut être un solvant organique, un acide ou un sel inorganique6;10. Pour chaque technique, le volume de réactif par rapport au volume de l’échantillon, le mécanisme de précipitaion du matériel protéique et le rendement de précipitation diffèrent. Dans ce travail, l’acétonitrile avec un rapport 2:1 a été choisi comme agent de précipitation car il offre plusieurs avantages. Bien qu’il implique une dilution d’un facteur trois de l’échantillon (qui peut être évitée en évaporant le solvant), il permet un effet de compression (« stacking ») notable lors de l’application de la haute tension11. En effet, le champ électrique local (i.e., à l’intérieur de la zone d’échantillon) est alors plus élevé, ce qui provoque une accélération des composés jusqu’à la limite de la zone d’injection (où le champ est plus faible). Les analytes sont par conséquent concentrés en une bande étroite, et l’efficacité ainsi que la sensibilité sont améliorées12. Ce phénomène est connu sous l’acronyme FASS (« field-amplified sample stacking »). De plus, c’est un solvant volatil, donc parfaitement compatible avec une détection ESI-MS, et aucun ajustement du pH du surnageant n’est nécessaire.
1.1.2. Extraction liquide-liquide (LLE)
La LLE est la procédure la plus employée pour l’extraction de composés pharmaceutiques des matrices biologiques. Elle consiste en une mise en contact entre une phase aqueuse (i.e., le fluide biologique) et une phase organique non-miscible. Le soluté dissous dans la matrice biologique est partagé entre les deux phases selon un taux de distribution qui dépend de la nature de la phase organique, du pH de la phase aqueuse et de la température. La LLE est une méthode relativement simple et abordable, et elle offre une excellente sélectivité. De plus, elle permet de pré-concentrer l’échantillon lorsque le solvant est évaporé en fin d’extraction et l’échantillon reconstitué dans un solvant permettant un effet
« stacking ». Elle présente cependant quelques limitations en termes de volumes de solvants organiques et d’automatisation. Finalement, elle est assez coûteuse en temps (ca. 100 min. par échantillon). Au cours de ce travail, la méthodologie suivante a été utilisée : du dichlorobutane est ajouté à l’échantillon plasmatique préalablement basifié. Le mélange immiscible est ensuite agité, centrifugé et
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congelé. La phase organique supérieure est récupérée, acidifiée, évaporée et le résidu reconstitué dans un minimum d’acétonitrile avant son injection dans le système CE-ESI-MS.
1.1.1.
1.222.... Procédure d’injection2 Procédure d’injectionProcédure d’injectionProcédure d’injection
Les deux principaux modes d’injection, hydrodynamique (HD) et électrocinétique (EK), ont été utilisés. Le premier consiste en l’injection par pression d’un volume d’échantillon égal à 1 % du volume du capillaire, tandis que le second implique l’application d’une tension pendant une courte période de temps, typiquement 10 kV pendant 10 s. Tandis que l’injection HD est indépendante de la nature de l’échantillon, l’injection EK est significativement influencée par celle-ci. En effet, des différences entre les échantillons, de conductivité ou de viscosité par exemple, peuvent exister (particulièrement dans le cas d’échantillons biologiques) et conduisent à une quantité différente de molécules introduites d’un échantillon à l’autre. L’injection EK ne peut donc être associée qu’à une préparation d’échantillon très nivelante. Pour cette raison, elle a été combinée à la LLE. De plus, l’injection EK permet l’introduction d’une quantité d’analytes dans le capillaire beaucoup plus importante que la HD. La combinaison LLE-EK a donc naturellement abouti à une augmentation d’un facteur 1000 de la limite de détection des analytes (ca. 1 ppb), en comparaison à l’association PP-HD. Cette différence est expliquée par (i) la capacité de la LLE à éliminer les interférents donc à diminuer le bruit de fond, (ii) l’intégration d’une étape d’évaporation en fin de LLE, et (iii) la reconstitution dans un solvant permettant un effet « stacking » important. Il est à noter que dans le cas d’une injection EK, l’effet « stacking » mentionné est connu sous l’acronyme FASI (« field-amplified sample injection ») et diffère du FASS car la pré-concentration dans le capillaire a lieu pendant l’injection dans le premier cas, tandis qu’elle est obtenue lors de l’application de la haute tension de séparation dans le second13.
1.3.1.3.1.3.
1.3. Analyses CEAnalyses CEAnalyses CEAnalyses CE----ESIESIESIESI----MS stéréosélectivesMS stéréosélectivesMS stéréosélectives MS stéréosélectives
L’utilisation de la CE-ESI-MS pour l’analyse chirale semble à priori difficile, car la présence de sélecteurs chiraux non-volatils peut provoquer une contamination de la
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source d’ionisation. L’utilisation du remplissage partiel (PFT, « partial filling technique ») peut être employée pour contourner cette limitation14;15. Cette approche consiste à remplir une portion discrète du capillaire avec le sélecteur chiral sélectionné, couramment des cyclodextrines (CDs). L’emploi de CDs avec une charge opposée à celle de l’analyte est particulièrement favorable au couplage CE-ESI-MS.
En effet, la portion de capillaire remplie peut être plus importante sans risquer la contamination de la source d’ionisation par les CDs, celles-ci migrant en direction de l’injection, à contre-courant des analytes migrant vers la détection (cc-PFT).
L’approche cc-PFT permet en outre de travailler avec des CDs chargées à de très faibles concentrations ainsi que d’augmenter la stéréosélectivité16;17 (grâce aux mobilités opposées des analytes et des CDs) voire d’effectuer des analyses chirales présentant des résolutions infinies18. Dans ce travail, des CDs hautement sulfatées (HS-γ-CDs) ont été utilisées car elles sont particulièrement adaptées à l’analyse chirale des composés basiques19-21.
min
Figure 1. Analyse CE-ESI-MS chirale des sept composés à 5 ppm dans le plasma après PP et injection HD.
La concentration en HS-γ-CDs (0.15 %) ainsi que la proportion de capillaire rempli (ca. 70 %) ont été optimisées afin d’obtenir une bonne énantioséparation des sept
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composés (cf. figure 1). L’analyse chirale a été effectuée avec les deux approches mentionnées précédemment (i.e., PP-HD et LLE-EK) et les niveaux de sensibilité obtenus sont convergents avec les résultats des analyses achirales : les limites de détection atteignent environ 0.5 ppm par énantiomère dans le plasma pour la première méthodologie et 0.2 ppb par énantiomère dans le plasma pour la seconde.
Il faut noter que la procédure LLE-EK a nécessité un ajustement de la méthode précédemment décrite. Comme la mobilité du sélecteur chiral est opposée à celle des composés, une irrépétabilité (i) de la quantité d’analytes injectés, (ii) de la quantité de sélecteur chiral dans le capillaire, et (iii) des temps de migration ainsi qu’une contamination de l’échantillon par les CDs ont été observées avec l’injection EK. Une petite zone de BGE (ca. 0.5 % du volume du capillaire) injectée hydrodynamiquement avant l’injection EK de l’échantillon a permis de résoudre ces problèmes.
1.1.1.
1.444.... Effet de matrice4 Effet de matriceEffet de matriceEffet de matrice
Lorsque des matrices complexes telles que les fluides biologiques sont analysées par CE-ESI-MS, il est important de considérer la potentielle suppression de l’ionisation des analytes d’intérêt. Celle-ci peut avoir lieu lorsque des composés endogènes ont été insuffisamment éliminés de la matrice biologique et co-migrent avec les analytes.
Ce phénomène, appelé « effet de matrice », est généralement observé lorsqu’une préparation d’échantillon peu sélective est utilisée. L’étude des effets de matrice en LC-ESI-MS est largement répertoriée22-24. Un des modes d’évaluation consiste en l’infusion post-colonne des composés d’intérêt alors que la matrice ayant subi la procédure de préparation d’échantillon est injectée dans le système LC-ESI-MS25. Une suppression de l’ionisation des composés est enregistrée et assimilée à un effet de matrice lorsque le signal de base ESI-MS diminue. En CE-ESI-MS, le liquide additionnel a été utilisé comme système d’infusion post-capillaire (cf. figure 2). Une solution à 1 ppm du mélange des produits dissous dans le liquide additionnel a été infusée à un débit de 3 µL·min-1 à travers le nébuliseur en configuration coaxiale. Des plasmas traités par les différentes préparations d’échantillon mentionnées précédemment (i.e., PP et LLE) ont été injectés dans le système et toute diminution significative du signal ESI-MS considérée comme un effet de matrice. La validité du montage a été
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confirmée par la suppression du signal ESI-MS des sept composés lorsqu’une solution de triéthanolamine, connue pour ses propriétés suppressives, a été injectée dans le système.
Liquide additionneladditionneladditionnel contenantadditionnelcontenantcontenantcontenant les analytes
nééébulisationébulisationbulisationbulisation
CE BGE volatilvolatilvolatilvolatil
Source de
Liquide additionneladditionneladditionnel contenantadditionnelcontenantcontenantcontenant les analytes
nééébulisationébulisationbulisationbulisation
CE BGE volatilvolatilvolatilvolatil
Source de
Figure 2. Dispositif expérimental pour l’évaluation des effets de matrice en CE-ESI-MS en utilisant l’interface coaxiale avec liquide additionnel comme système d’infusion post-capillaire.
L’injection de BGE a constitué la référence (fig. 3A). Les plasmas traités par PP ont présenté une suppression de signal entre 6 et 8 min. (fig. 3C). Cet effet de matrice est dû à la présence de composés endogènes puisque de l’eau traitée par la même PP a donné un signal comparable à celui du BGE (fig. 3B).
100
Figure 3. Electrophérogrammes ESI-MS obtenus avec le système d’infusion post-capillaire pour l’analyse de A) BGE, B) eau traitée par PP, C) plasma blanc traité par PP, et D) plasma dopé avec le mélange de composés à 50 ppm et traité par PP.
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La présence d’un effet de matrice ne compromet cependant pas le dosage des molécules d’intérêt dans la mesure où ces dernières ont migré au-delà de la zone de suppression, entre 8 et 10 min. (fig. 3D). Aucun effet de matrice n’a été relevé pour les plasmas traités par LLE car les traces ESI-MS ont toutes été comparables à celle obtenue après injection de BGE.
Il est à noter que les effets de matrice sont largement différents selon le fluide biologique considéré. L’urine présente par exemple de nombreux composés endogènes (notamment des acides gras) et surtout une grande variabilité inter- et intra-individuelle. Une préparation d’échantillon très sélective est particulièrement indlquée dans ce cas.
1.1.1.
1.555.... Performances quant5 Performances quantPerformances quantPerformances quantitativesitativesitativesitatives
Une fois les méthodes développées pour l’analyse des différents énantiomères dans le plasma, une procédure de validation a été mise en place afin de démontrer qu’elles correspondent à l’usage pour lequel elles sont prévues26-28. Pour l’analyse pharmaceutique, la référence internationale en matière de validation analytique repose sur des textes publiés dans le cadre de conférences internationales pour l’harmonisation des procédures de validation (ICH, « international conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use »). L’objectif d’une procédure de validation est de donner au laboratoire et aux autorités des garanties suffisantes que chacune des mesures qui seront réalisées en routine avec ces méthodes seront proches des vraies valeurs. Une procédure de validation consiste à simuler le travail de routine en utilisant des échantillons de concentration connue, appelés contrôles de qualité (QC), et le principe de l’étalonnage inverse.
La stratégie appliquée lors de ce travail s’est basée sur l’approche proposée par la société française des sciences et techniques pharmaceutiques (SFSTP)29-31. Le protocole V5 a été sélectionné et consiste en (i) un calibrage dans la matrice biologique, et (ii) une validation sur trois jours d’analyse (j=3), avec extinction de l’instrument entre chaque jour d’analyse et préparation des solutions chaque jour.
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Trois niveaux de concentration ont été évalués (k=3), avec un minimum de deux injections par niveau (n≥2), et une préparation indépendante de chaque échantillon injecté. Différents critères ont été évalués en accord avec les normes reconnues pour le dosage de composés dans les fluides biologiques. Il s’agit de (i) la sélectivité, (ii) la fonction réponse, (iii) la justesse, (iv) la fidélité, (v) l’exactitude, (vi) la linéarité, et (vii) la limite de quantification (LOQ). L’étude a été effectuée sur une sélection de deux composés parmi le cocktail de molécules, à savoir l’ecstasy (MDMA) et la méthadone (MTD). Des standards internes (SI) deutérés chiraux ont été choisis afin de (i) corriger les variabilités dues à la méthode (e.g. préparation d’échantillon, injection, électro-osmose), (ii) corriger les éventuels effets de matrice, et (iii) se soustraire de la variabilité de l’ionisation. En effet, il a été démontré que le rendement de l’ionisation ESI varie au cours du temps, à très court terme (de l’ordre de la s)32;33. Seule l’utilisation de SI co-migrant avec les analytes d’intérêt permet
MTD MTDMTDMTDMTD
MDMA
MTD MTDMTDMTDMTD
MDMA
Figure 4. Détermination de la sélectivité des méthodes CE-ESI-MS A) PP-HD, et B) LLE-EK.
La méthode d’analyse est dite sélective si elle délivre un signal qui permet de distinguer les analytes d’intérêt de tous les autres constituants d’un échantillon (e.g.
interférents, métabolites, co-médication, etc). La sélectivité des deux méthodologies
Chapitre 2 Chapitre 2 Chapitre 2
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a été déterminée en comparant les électrophérogrammes obtenus après injection d’un plasma blanc (CAL00), d’un plasma dopé avec les SI (CAL0), et d’un plasma dopé avec les analytes d’intérêt et les SI (CAL1). Aucune interférence n’a été observée pour le dosage des composés d’intérêt, quels que soient les méthodologies et les composés considérés (cf. figure 4).
1.5.2. Fonction réponse
Elle traduit, à l’intérieur de l’intervalle de dosage, la relation qui existe entre la réponse (i.e., rapport de l’aire de l’analyte sur l’aire du SI) et la concentration de la substance examinée dans l’échantillon. La fonction réponse peut être linéaire (droite), mais il existe des situations de courbure intrinsèque liées notamment à certains systèmes de détection ou à l’étendue de l’intervalle de dosage. En revanche, il est nécessaire que la fonction de réponse soit strictement croissante ou décroissante (i.e., fonction monotone). Il faut encore relever que l’estimation d’une telle fonction par les méthodes habituelles d’ajustement (e.g. méthode des moindres carrés) postule la constance de la variabilité de la réponse à toutes les concentrations (i.e., homogénéité des variances) alors que cette hypothèse ne se vérifie pas toujours lorsque l’intervalle de dosage est très étendu. Dans ce travail, les modèles de régression suivants ont été évalués : (i) la fonction linéaire, (ii) la fonction linéaire passant par l’origine, (iii) la fonction linéaire pondérée (facteurs de pondération 1/x et 1/x2), (iv) la fonction linéaire après transformation par la racine carrée (appliquée à la concentration x et à la réponse y), et (v) la fonction linéaire après transformation par le logarithme décimal (appliqué à la concentration x et à la réponse y). Le modèle sélectionné correspond à celui qui permet d’obtenir les meilleures performances quantitatives en termes d’exactitude pour chaque composé (MDMA et MTD), méthodologie (PP-HD et LLE-EK) et gamme de concentrations considérés. Dans tous les cas, il s’avère que la fonction linéaire après transformation par la racine carrée a donné les meilleures performances quantitatives. Cette fonction réponse représente donc la courbe d’étalonnage qui sera par la suite utilisée pour calculer les concentrations dans des échantillons inconnus.