Pompage
Réflecteur Coupleur
Résonateur optique
Faisceau laser Milieu actif
Pompage
Figure 14.
Figure 14.Figure 14.
Figure 14. Schéma de principe du fonctionnement d’un laser.
L’émission stimulée d’un photon de fréquence désirée se produit dans le milieu actif quand il y a inversion de population, en d’autres termes, l’état initial est moins peuplé que l’état excité (état métastable). L’énergie nécessaire à cette inversion est fournie par le pompage (cf. figure 14). Une particule se trouvant à l’état métastable le reste suffisamment longtemps pour que d’une part l’inversion de population soit possible et que d’autre part le phénomène d’émission spontanée ait lieu. S’il n’y a pas d’inversion de population dans le milieu actif, le rayonnement laser ne peut être obtenu. Toutefois, l’inversion de population ne suffit pas à elle seule à produire un faisceau laser. Pour cette raison, le milieu actif est placé dans un résonateur optique.
Il est constitué de deux miroirs parallèles entre lesquels est placé le milieu actif. Le premier miroir, appelé réflecteur, est totalement réfléchissant tandis que le second, appelé coupleur, est semi-transparent. Ce dernier permet à la lumière de sortir tandis
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 2626 2626
que le résonateur contribue à l’amplification de la lumière dans le laser. Ainsi, les photons en étant réfléchis par les miroirs peuvent traverser plusieurs fois le milieu actif et provoquer l’émission stimulée d’un plus grand nombre de photons.
Généralement le résonateur est construit de manière à favoriser l’une des longueurs d’onde produites dans le milieu actif au détriment des autres. Pour cela, la longueur de résonateur répond à l’équation 4.
L=n·λ Equation 4
Où : L=longueur du résonateur n=nombre entier positif λ=longueur d’onde
Enfin, la lumière émise par le laser peut être soit continue (« continuous wave », CW) soit pulsée (durée des pulses de l’ordre de la ns, fréquence de l’ordre de la dizaine de kHz). Cela dépend du mécanisme de pompage utilisé pour exciter le milieu actif et de la capacité du milieu actif à supporter l’énergie qui lui est fournie. Il existe une grande variété de lasers pour répondre aux besoins de la plupart des applications (cf.
tableau 2). Il est possible de les classer en trois catégories selon le milieu actif : (i) gaz, (ii) solide, ou (iii) semi-conducteur94;95.
3.2.1. Lasers à gaz
Les lasers à gaz ont un milieu actif gazeux (pur ou mélange). Le milieu est habituellement excité par une décharge électrique, mais le pompage peut aussi être optique. Dans le laser à hélium-cadmium par exemple, le cadmium représente la source d’excitation, tandis que l’hélium joue le rôle de starter. C’est l’ionisation des atomes de cadmium par les atomes métastables d’hélium qui produit l’inversion de population nécessaire à la formation du faisceau lumineux monochromatique de longueur d’onde 325 ou 442 nm. Le choix du bloc filtre permet de sélectionner l’une des deux longueurs d’onde désirée. Les lasers à gaz sont d’une efficacité moyenne, d’une directivité du faisceau exceptionnelle et d’une puissance variable. Ces lasers ont le désavantage d’être coûteux, instables et d’avoir une durée de vie relativement courte96.
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 2727 2727
Tableau 2.
Tableau 2.Tableau 2.
Tableau 2. Différents lasers commercialisés.
Laser Laser Laser Laser Nature du milieu actif
Nature du milieu actifNature du milieu actif
Nature du milieu actif RégimeRégimeRégimeRégime
Longueur d’onde Longueur d’onde Longueur d’onde Longueur d’onde
d’excitation d’excitation d’excitation d’excitation
(nm) (nm) (nm)
(nm) GazGazGazGaz SolideSolideSolideSolide SemiSemi----SemiSemi cond.
cond.
cond.
cond.
CW CW CW
CW Pulsé Pulsé Pulsé Pulsé (kHz) (kHz) (kHz) (kHz)
Puissance PuissancePuissance Puissance
(mW) (mW)(mW) (mW)
244 Ar X 5
266 Nd:YAG 10 ca. 2
284 Kr-F 10 ca. 5
325 He-Cd X 15
355 Nd:YAG 10 ca. 2
410 GaAlAs X 15
442 He-Cd X 30
488 Ar X 25
514 Ar X 15
532 Nd:YAG X 25
594 He-Ne X 2
633 He-Ne X 10
650 GaAlAs X 15
780 GaAlAs X 40
3.2.2. Lasers à solides
Les lasers à solides utilisent des verres ou des cristaux comme milieu actif. Ce dernier se présente sous forme de tige dont les extrémités sont parfaitement parallèles et ont été recouvertes d’un matériau réfléchissant. Les lasers à solides sont généralement utilisés en mode pulsé et fonctionnent le plus souvent grâce à un pompage optique, par une lampe à décharge ou un autre laser. Ils couvrent une grande partie du spectre électromagnétique, de l’infrarouge à l’ultraviolet. Toutefois,
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 2828 2828
leur milieu actif s’endommage si la température devient trop élevée, induisant des défauts irréversibles pour le laser. Cela explique en partie pourquoi les lasers à solides fonctionnent plutôt en régime pulsé, ce qui permet en effet de ménager le matériau.
Figure 15.
Figure 15.Figure 15.
Figure 15. Tiges de Nd:YAG pour lasers à solides.
Un exemple de laser à solides est constitué de cristaux de Nd:YAG (cf. figure 15).
YAG est l’acronyme d’yttrium aluminium garnet et désigne le solide Y3Al5O12. La lumière de ce type de laser est émise par des impuretés (cristal dit dopé) de néodyme (Nd3+) qui produisent un rayonnement infrarouge à une longueur d’onde de 1064 nm qui peut être doublée, triplée ou quadruplée à 532, 355 et 266 nm, respectivement. L’intensité du faisceau et la durée des pulses sont variables selon les fabricants97. Les lasers à solides ont le désavantage majeur d’être très chers et de souvent nécessiter une infrastructure de laboratoire particulière. Le laser à 266 nm présente un intérêt particulier, car à cette longueur d’onde, certaines molécules présentent des caractéristiques intrinsèques fortes de fluorescence permettant ainsi d’éviter de les dériver pour détecter la fluorescence87;98. Cela peut s’avérer très avantageux en particulier lorsque la réaction de dérivation est problématique. Par exemple, lorsque les volumes d’échantillon sont petits (<1 µL) et/ou que les concentrations d’analytes sont faibles (<10-7 M)99. De plus, la réaction de dérivation peut être incomplète et induire des interférences avec l’analyte et la détection100. 3.2.3. Lasers à semi-conducteurs
Les lasers à semi-conducteurs sont composés de deux couches qui sont des bandes de conduction et de valence séparées par une zone d’énergie interdite (fig. 16A).
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 2929 2929
L’une contient un excès d’électrons (n-région, « n » pour négative) et l’autre est déficiente en électrons (p-région, « p » pour positive, fig. 16B) et est formée de trous. Ces trous sont en fait des vides laissés par des électrons de valence qui ont gagné suffisamment d’énergie (équivalente à la bande interdite) pour passer du réseau covalent du semi-conducteur à la bande de conduction, ce qui permet à un courant électrique de circuler dans le matériau. Lorsqu’une différence de potentielle est appliquée entre ces deux couches, des électrons et des trous sont injectés dans la p-région et dans la n-région, respectivement (fig. 16C-D). Dans des conditions particulières, les électrons et les trous peuvent coexister un certain laps de temps (de l’ordre de la µs, fig. 16E) avant de se recombiner. La recombinaison trous-électrons constitue l’émission stimulée décrite précédemment (fig. 16F).
Bande interdite
Figure 16. Schéma du principe d’émission stimulée d’un laser à semi-conducteurs : A) passage d’une petite portion d’électrons de la bande de valence à la bande de conduction, B) création d’une p-région (bande de valence déficiente en électrons) et d’une n-région (bande de conduction avec un excès d’électrons), C) application d’une différence de potentiel entre les deux régions, D) injection d’électrons dans la bande de valence et de trous dans la bande de conduction, E) coexistence trous-électrons, et F) recombinaison trous-électrons avec émission d’un photon d’énergie équivalente à la bande interdite.
La longueur d’onde du laser dépend de la bande interdite, c'est-à-dire du niveau d’énergie entre la p-région et la n-région. Les semi-conducteurs purs comme le silicium ou le germanium ont peu d’intérêt pour la fabrication de ce type de lasers.
Les semi-conducteurs dopés (i.e., contenant des impuretés) sont préférés, comme
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 3030 3030
l’arséniure de gallium dopé à l’aluminium (GaAlAs) qui émet à 410 nm par exemple, ainsi qu’à des longueurs d’onde proches de l’infrarouge. Les principaux avantages des lasers à semi-conducteurs sont leur stabilité élevée, leur coût faible et leur relativement longue durée de vie90.
3.3.3.3.3.3.
3.3. Réactions de dérivationRéactions de dérivationRéactions de dérivationRéactions de dérivation
La détection de molécules nativement fluorescentes est une perspective maintenant accessible grâce à l’introduction des lasers émettant dans le proche UV. Cependant, la proportion de composés pharmaceutiques présentant des caractéristiques intrinsèques fortes de fluorescence, bien que significative, reste faible (ca. 20 %)101. Afin d’augmenter le nombre de molécules détectables, des agents de dérivation sont donc nécessaires, particulièrement aux longueurs d’onde d’excitation éloignées de l’UV. Il s’agit de faire réagir un composé appelé fluorophore, qui possède nativement de bonnes propriétés fluorescentes comme un coefficient d’absorption molaire ( ) et/ou un rendement quantique de fluorescence ( f) élevés, avec l’analyte. Les fluorophores les plus souvent utilisés comportent un ou plusieurs cycles aromatiques et possèdent une structure rigide. La substitution sur un cycle aromatique modifie la longueur d’onde des maxima d’absorption. Généralement, un substituant donneur d’électrons augmente la fluorescence tandis qu’un substituant attracteur d’électrons la diminue. Certains agents de dérivation ne sont pas fluorescents mais fluorogènes.
Ces derniers deviennent fluorescents après réaction avec l’analyte. Ils peuvent donc être injectés en excès dans le système CE-LIF sans interférer avec la détection. Il existe un nombre relativement important d’agents de dérivation commercialisés (cf.
tableau 3) mais de nombreux impératifs en limitent le choix. En effet, pour être idéal, un agent doit regrouper les caractéristiques suivantes : (i) posséder un taux de réaction rapide avec les analytes pour que la dérivation se fasse même quand les analytes se trouvent à de faibles concentrations, (ii) former des complexes hautement fluorescents avec une longueur d’onde d’excitation proche de celle du laser, (iii) être chimiquement stable et photostable102, et (iv) former un seul dérivé pour chaque analyte et ne pas perturber la séparation ou le mode de détection103. De plus, la nature des analytes recherchés et l’équipement du laboratoire (i.e., type de laser) guide le choix du réactif.
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 3131 3131
Tableau 3.
Tableau 3.Tableau 3.
Tableau 3. Différents agents de dérivation utilisés en LIF.
Cible CibleCible
Cible Agent de dérivationAgent de dérivationAgent de dérivationAgent de dérivation Longueur d’onde Longueur d’onde Longueur d’onde Longueur d’onde d’excitation (nm) d’excitation (nm) d’excitation (nm) d’excitation (nm) Amine primaire
Amine primaireAmine primaire
Amine primaire Orthophthaldialdéhyde (OPA) 325
Fluorescamine (FLUM) 355
Naphtalène 2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) 442
3-(4-carboxybenzoyl)-quinoline-2-carboxaldéhyde (CBQCA)
442
Amine secondaire Amine secondaireAmine secondaire
Amine secondaire Dansyl chloride 325
Fluorescéine isothiocyanate (FITC) 488 5-carboxyfluorescéine succinimidyl ester
(CFSE)
488
4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F)
488
Alcool AlcoolAlcool
Alcool Fluorescéine-5-carbonylazyde 488
Hémiacétal HémiacétalHémiacétal
Hémiacétal Aminobenzamide 325
Fluorescamine (FLUM) 355
9-aminonaphtalène-1,4,6-trisulfonate (ANTS)
355
9-aminopyrène-1,4,6-trisulfonate (APTS) 488 Acide carboxylique
Acide carboxyliqueAcide carboxylique
Acide carboxylique 9-fluorénylméthyloxycarbonyl (FMOC) 266/284
5-bromométhyl fluorescéine (BrF) 488
Thiol ThiolThiol
Thiol 4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F)
488
5-iodo-acétamido-fluorescéine (IAF) 488 Aldéhyde / Cétone
Aldéhyde / CétoneAldéhyde / Cétone
Aldéhyde / Cétone Fluorescéine-5-thiosemicarbazide 488
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 3232 3232
Actuellement, la limite de sensibilité par analyse CE-LIF n’est pas due au détecteur mais aux agents de dérivation102. Cette dernière, outre rendre le composé à analyser fluorescent, peut également modifier son rapport charge/taille et son hydrophilie ou encore convertir des énantiomères en stéréoisomères qui peuvent être séparés dans des conditions non-chirales104. Il existe trois différents modes de dérivation : pré-capillaire, dans le capillaire (« in-capillary ») et post-capillaire.
3.3.1. Dérivation pré-capillaire
La dérivation pré-capillaire consiste à faire réagir les composés à analyser avec le réactif avant l’injection de l’échantillon dans le capillaire. On distingue les dérivations
« off-line » qui impliquent que les réactions soient effectuées indépendamment du système CE-LIF. Rarement, les analytes peuvent être mélangés avec le réactif juste avant le capillaire grâce à une jonction T en mode « on-line ». Le premier mode est le plus employé de nos jours car de nombreuses réactions de dérivation nécessitent des conditions particulières comme une température élevée ou un long temps de réaction. Il est également possible d’éliminer l’excès de réactif soit par extraction, soit par évaporation. La réaction peut être réalisée par exemple dans une éprouvette. On parle alors d’une dérivation en phase liquide. Une autre possibilité consiste à dériver l’analyte sur un support solide porteur du fluorophore, afin d’également purifier l’échantillon et d’éliminer les potentielles réactions secondaires et interférents fluorescents avant l’analyse. Cette approche est appelée dérivation sur support solide et possède un certain intérêt lorsqu’il s’agit de dériver des composés présents dans des matrices complexes tels les fluides biologiques, pour lesquels une étape de préparation d’échantillon est de toute manière nécessaire.
3.3.2. Dérivation dans le capillaire
Avec le deuxième mode, dit « in-capillary », la réaction entre les analytes et le réactif a lieu dans le capillaire. La dérivation peut avoir lieu au début, au milieu ou tout au long du capillaire grâce à la différence de vitesse de migration entre le réactif et les composés. Ces derniers sont introduits soit en mode tandem (e.g. réactif puis analytes), soit en mode sandwich (réactif-analytes-réactif). Ce mode est
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----LIF Couplage CELIFLIFLIF 3333 3333
particulièrement adapté pour les échantillons de très petit volume car il évite les dilutions, la perte ou l’évaporation des solutions105. Il existe une variante à ce mode où le réactif est directement incorporé dans la solution tampon du capillaire106. Il faut noter qu’avec ce mode, la réaction doit être effectuée rapidement et le réactif doit être fluorogène. Par contre, cette méthode est facilement automatisable et est ainsi davantage compatible avec les analyses de routine104.
3.3.3. Dérivation post-capillaire
Le mode de dérivation post-capillaire comporte l’avantage sur les deux précédents de permettre la migration et la séparation des composés sous leur forme native avant que la dérivation soit effectuée. Les interférences causées par les produits secondaires issus de la réaction sont ainsi évitées. Cependant, il existe de nombreux inconvénients pour ce mode dont les principaux sont une perte d’analytes, une réaction incomplète, un bruit de fond plus élevé104 et un élargissement des pics dû à l’augmentation de la turbulence lors de l’addition du réactif par un capillaire secondaire103.
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----EC Couplage CEECECEC 3434 3434
4. 4. 4.
4. Couplage CE Couplage CE Couplage CE Couplage CE----EC EC EC EC
Le couplage de l’électrophorèse capillaire (CE) avec une détection électrochimique (EC) est une réelle alternative aux deux modes de détection étudiés précédemment (MS, LIF). De manière générale, on distingue trois techniques dites électrochimiques, l’ampérométrie (AP), la potentiométrie (PT) et la conductimétrie (CD). Cette dernière est parfois dissociée des deux autres méthodes car aucun mécanisme d’oxydation/réduction n’intervient dans la mesure. La CD est considérée ici comme une technique électrochimique proprement dite car certains aspects et problématiques instrumentales sont communes aux trois techniques. Puisque la détection PT n’a pas du tout été abordée au cours de cette thèse, seules les détections AP et CD sont traitées ici.
444
4....1111 Détection ampérométriqueDétection ampérométriqueDétection ampérométriqueDétection ampérométrique (AP) (AP) (AP) (AP)
L’ampérométrie implique l’application d’un potentiel sur une électrode de travail. Le courant faradique qui résulte de l’oxydation ou de la réduction du composé d’intérêt à ce potentiel constitue la mesure qui est directement proportionnelle à la concentration de l’analyte considéré. Le composé d’intérêt doit donc être électroactif afin d’être analysé, ce qui peut restreindre le domaine d’applications de ce couplage. Cet aspect peut au contraire être source de sélectivité supplémentaire afin de discriminer les composés potentiellement co-migrants mais ne possédant pas de potentiel d’oxydo/réduction dans le domaine de polarisation de l’électrode de travail. Le principal intérêt de la détection AP est son gain en sensibilité par rapport à la détection UV/Vis classique. Elle offre en outre d’autres avantages lorsqu’elle est couplée à la CE : (i) elle est idéalement adaptée aux petites dimensions de la CE. Des microélectrodes de quelques µm sont couramment utilisées dans de nombreuses applications CE-EC et la construction de ces électrodes est facilement achevée sans que les performances analytiques ne souffrent de cette miniaturisation, au contraire des techniques de détection optique. En effet, de très faibles courants (nA voire pA) peuvent être précisément mesurés avec des microélectrodes. Comme le bruit généré à la surface décroît de façon supérieure avec la diminution de la surface de l’électrode que ne le fait l’intensité du signal, la sensibilité est améliorée avec
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----EC Couplage CEECECEC 3535 3535
l’emploi de telles microélectrodes. Cette propriété est d’autant plus intéressante qu’une tendance instrumentale majeure concerne la miniaturisation complète des systèmes séparatifs, et plus particulièrement de la CE. La détection EC apparaît donc très attractive dans cette perspective ; (ii) elle présente un coût très compétitif en termes d’instrumentation et d’utilisation par rapport aux autres détecteurs ; et (iii) elle profite de plusieurs décennies de recherche et de développement, par conséquent de très nombreux couples électrodes/analytes ont été caractérisés et peuvent directement être adaptés à l’analyse CE-AP.
Seuls les aspects techniques relatifs au couplage CE-AP sont traités ici, sachant que son succès réside dans la résolution de deux problèmes techniques majeurs : (i) le découplage des circuits électrophorétique et ampérométrique, et (ii) l’alignement de l’électrode de travail à l’extrémité du capillaire.
4.1.1. Découplage des circuits électriques
La nécessité d’isoler le circuit électrique séparatif de celui du détecteur s’explique par les hautes tensions appliquées en CE (i.e., 5-30 kV) qui génèrent des courants électrophorétiques de plusieurs µA. Ces derniers peuvent interférer avec les potentiels typiquement appliqués en ampérométrie (ca. 1 V) et les courants couramment mesurés (quelques pA). Il apparaît donc essentiel de minimiser et de contrôler ces interférences pour obtenir des performances CE-AP optimales. Deux approches sont couramment rencontrées, (i) la détection « off-capillary », et (ii) la détection « end-capillary ».
La détection « La détection «La détection «
La détection « offoffoffoff----capillarycapillarycapillarycapillary ».».».». Dans la plupart des montages, le découplage est accompli en insérant une petite fracture avant l’extrémité du capillaire CE (ca. à 1 cm). Cela permet de maintenir la proximité entre l’extrémité du capillaire et l’électrode de travail mais de diviser le capillaire en deux parties électriques distinctes : (i) le capillaire de séparation, et (ii) le capillaire de détection (fig. 17A).
La fracture est relativement fine (quelques µm) et est reliée électriquement à la solution de BGE dans laquelle est introduite la seconde électrode nécessaire à l’application de la haute tension. Ainsi, cette dernière est uniquement appliquée
Chapitre 1 Chapitre 1 Chapitre 1
Chapitre 1 | Couplage CE Couplage CE Couplage CE----EC Couplage CEECECEC 3636 3636
entre les deux extrémités du capillaire de séparation, et le courant électrophorétique peut s’échapper par la fracture, pendant que les espèces séparées et le BGE continuent de migrer à travers le capillaire de détection jusqu’à l’électrode de travail.
Techniquement, la fracture est obtenue en griffant le capillaire avec un diamant. Elle est ensuite recouverte avec un revêtement conducteur pour éviter que le BGE ne s’introduise dans la fracture, et pour maintenir l’intégrité physique du capillaire et la conduction électrique. La fracture est complètement achevée en cassant le capillaire par torsion. Les nombreux systèmes de découplage développés diffèrent principalement par la nature du matériau utilisé pour le revêtement conducteur.
Initialement, du verre poreux107, actuellement du Teflon108;109 et voire plus couramment du Nafion110-112. Ce dernier présente en effet des avantages en termes de tailles et formes variables, conductivité élevée, souplesse à la manipulation et disponibilité commerciale. De manière générale, les systèmes « off-capillary » présentent une bonne qualité de suppression du bruit de fond interférent, mais
Initialement, du verre poreux107, actuellement du Teflon108;109 et voire plus couramment du Nafion110-112. Ce dernier présente en effet des avantages en termes de tailles et formes variables, conductivité élevée, souplesse à la manipulation et disponibilité commerciale. De manière générale, les systèmes « off-capillary » présentent une bonne qualité de suppression du bruit de fond interférent, mais