Phénotypes germinaux causés par la perte de fonction de gènes de la voie des

Dans cette section, les défauts de la lignée germinale qui résultent de la perte des composantes de la voie de la biogenèse de miARN sont décrits.Étant donné que les voies des miARN et des siARN endogènes partagent des composantes protéiques, leurs fonctions et caratéristiques respectives seront comparées afin d’en améliorer la compréhension.

Figure 1.8 - La perte des gènes nécessaires à la voie microARN entraîne des défauts de la lignée germinale femelle chez l'animal.

Gauche : Représentation schématique de la voie de biogénèse des miARN. Droite :

Phénotypes germinaux observés chez C. elegans, D. melanogaster, D. rerio et M. musculus lorsque les gènes orthologues DGCR8, Drosha, Dicer et Argonautes sont mutés. Les cadres à ligne pleine représentent l’analyse d’un mutant nul de l’animal, et les cadres à ligne pointillée représentent l’analyse d’un mutant spécifique aux cellules germinales. Les cases sans cadre indiquent qu’un mutant nul n’existe pas. N.D. Non déterminé expérimentalement ; l’analyse des phénotypes germinaux n’est pas publiée.

L'enzyme ribonucléase III Drosha interagit avec deux protéines DGCR8 pour former le complexe Microprocesseur qui reconnaît, mesure et clive la structure en tige-boucle des miARN primaires pour produire des miARN précurseurs (Ha and Kim 2014, Nguyen et al.

2015). Tout comme Dicer, DGCR8 et Ago2, Drosha est essentiel pour la viabilité des animaux. Chez C. elegans, la délétion du gène codant pour Drosha (drsh-1) entraîne la stérilité, et la perte de drsh-1 uniquement dans la lignée germinale entraîne une diminution du taux d’ovulation et la stérilité (Denli et al. 2004, Rios et al. 2017). La délétion de Drosha chez la drosophile affecte la division des cellules germinales et la formation des oocytes (Azzam et al. 2012).

Cependant, des études récentes réalisées dans des cellules somatiques ont montré que Drosha est également impliqué dans l'épissage et la biogénèse d'une grande variété d'ARNm contenant des structures secondaires en forme de tige-boucles (Burger and Gullerova 2015), en plus d’être impliqué dans la biogenèse d’ARN ribosomaux (Liang and Crooke 2011). Drosha est aussi requise pour le maintien de la méthylation de l’ADN (Stathopoulou et al. 2017), un processus essentiel dans la lignée germinale et l’embryon, entres autres, pour le contrôle des éléments transposables, le dosage de l’expression chromosome X et la transmission héréditaire de certains traits (Seisenberger et al. 2012, Smith et al. 2012). Il est intriguant de constater que ces processus sont aussi contrôlés par les piARN (Ishizu et al. 2012, Tang et al. 2018). Par conséquent, les phénotypes et les changements moléculaires provoquées par la perte de fonction de Drosha pourraient résulter soit de fonctions de Drosha liées à aux miARN, soit de fonctions indirectes, soit de la contribution additive des deux.

La biogénèse des pri-miARN dépend également de DGCR8, un cofacteur de Drosha. L'abrogation de pash-1, le gène orthologue de DGCR8 chez le nématode, provoque la stérilité (Denli et al. 2004, Lehrbach et al. 2012). Les effets moléculaires liés à la perte de pash-1, l’orthologue de DGCR8, spécifiquement dans la lignée germinale ont été étudiés chez C. elegans (Rios et al. 2017). L’analyse phénotypique de mutants pash-1(mj100ts) exprimant un transgène rétablissant l’expression de pash-1 uniquement dans les cellules somatiques suggère l’implication de la voie des miARN dans le processus d’ovulation (Rios et al. 2017). Chez la drosophile, la perte de Pasha entraîne des anomalies de la division cellulaire et de la formation des oocytes, ce qui entraîne également la stérilité (Azzam et al. 2012). La perte conditionnelle de Dgcr8 dans la lignée germinale femelle de

la souris entraîne la perte de miARN matures, mais les oocytes sont capables de compléter la méiose (Suh et al. 2010). De plus, les oocytes Dgcr8-/- possèdent un transcriptome relativement normal comparativement à ceux des oocytes de type sauvage (Suh et al. 2010). Fait important, tout comme pour Drosha, il semble exister un rôle pour DGCR8 dans des voies non reliées à la voie des miARN. Via son association avec Drosha, DGCR8 contrôle la biogénèse de nombreux ARNm et longs ARN non-codants (Macias et al. 2012). DGCR8 contribue également à la dégradation de différents ARN en recrutant le complexe exosome de façon indépendante de Drosha à des snoARN et à des ARN télomériques (Macias et al. 2012, Macias et al. 2015). Par conséquent, il est important de considérer soigneusement les analyses phénotypiques et moléculaires des facteurs de miARN, de faire la distinction entre les effets médiés par les miARN, d'autres effets de traitement de l'ARN et les phénotypes indirects résultant de la mauvaise régulation de gènes particuliers.

Dicer est une enzyme de type RNAse III qui clive le pré-miARN pour produire un duplexe de miARN d’environ 22 nucléotides de long. Dicer est également impliqué dans la biogénèse des endo-siARN. Les endo-siARN sont une famille de courts ARN dont les précurseurs, de longs ARN double-brin, sont en général clivés par Dicer, de façon indépendante du Microprocesseur Drosha/DGCR8 (Claycomb 2014). Ils forment un complexe effecteur avec une protéine Argonaute et peuvent réguler l'expression des gènes à deux niveaux, soit transcriptionnel et/ou post-transcriptionnel. Les endo-siARN sont enrichis dans les oocytes et en cellules souches embryonnaires chez les mammifères (Watanabe et al. 2008). Leur rôle essentiel durant la méiose a été découvert récemment et est discuté plus loin (Stein et al. 2015).

Puisque les endo-siARN ne sont pas clivés au noyau par le Microprocesseur, des mutants Dgcr8 et Dicer ont été utilisés pour déduire la contribution relative des miARN et des endo- siARN à la régulation des gènes. La perte de Dgcr8 altère la production de miARN canoniques alors que la délétion de Dicer bloque à la fois la production d'endo-siARN et de miARN. Chez la souris, la perte de Dicer restreinte aux tissus de la lignée germinale femelle entraîne des défauts de l'intégrité du fuseau méiotique de l'oocyte, un blocage en méiose I ainsi qu’une altération substantielle du transcriptome (Murchison et al. 2007). Les

transcrits dont le niveau est augmenté dans les oocytes Dicer-/- présentent une forte corrélation avec un groupe d’ARNm connus pour être dégradés durant la maturation des oocytes. Cependant, ils ne montrent aucun enrichissement significatif pour des sites de liaison par des miARN (Murchison et al. 2007, Tang et al. 2007). Considérant l'absence de changements substantiels du transcriptome des oocytes Dgcr8-/- (Suh et al. 2010), ces résultats suggèrent que les endo-siARN dépendant de Dicer sont les principaux acteurs du contrôle de la stabilité du transcriptome des oocytes. Par conséquent, il n'est pas clair si la fonction des miARN est spécifiquement inhibée, ni comment leurs cibles sont régulées au cours de la croissance et de la maturation des oocytes.

Chez C. elegans, la mutation du gène codant pour Dicer, dcr-1, rend les animaux stériles et entraîne une maturation inadéquate des oocytes (Grishok et al. 2001, Ketting et al. 2001, Knight and Bass 2001). Cependant, seulement l’activité de dcr-1 dans la gonade somatique est nécessaire pour la fertilité ; la lignée germinale dépourvue de dcr-1 produit des oocytes normaux (Drake et al. 2014). De plus, cet article a montré que la phosphorylation de Dicer par ERK est conservée de manière évolutive et est essentielle pour l'oogenèse et le début de l’embryogenèse chez le nématode (Drake et al. 2014). La phosphorylation de Dicer a un impact sur la production de miARN et d'ARN-26G, un groupe de siARN endogènes germinaux spécifiques au nématode (Piatek and Werner 2014). Ce travail dévoile un contrôle spatio-temporel et post-traductionnel de la fonction de Dicer : sa déphosphorylation favoriserait la production de petits ARN avant la transition de l'ovocyte à l'embryon. Ceci supporte l'implication des endo-siARN et des miARN dans la régulation du transcriptome maternel, sans distinction entre les deux familles de courts ARN.

Cependant, durant l’oogénèse, les animaux semblent avoir des exigences différentes pour les miARN et les endo-siARN. Drosophila melanogaster exprime deux isoformes de Dicer : Dicer-1 (Dcr-1) étant responsable de la production de miARN et Dicer-2 (Dcr-2) pour les endo-siARN (Lee et al. 2004). Alors que Dcr-1 est nécessaire pour la division des cellules germinales et la formation d'oocytes (Hatfield et al. 2005, Jin and Xie 2007), Dcr-2 ne l'est pas (Lee et al. 2004). Ceci pourrait signifier soit 1) qu’un mécanisme existe pour compenser la perte des endo-siARN, ou 2) que les endo-siARN n'ont pas le même rôle dans

la maturation des oocytes de la drosophile, comparé au nématode ou à la souris (Shcherbata et al. 2007). Les cellules germinales du poisson-zèbre, lorsque dépourvues de Dicer, prolifèrent et génèrent des oocytes qui peuvent être fertilisés (Giraldez et al. 2005). Somme toute, la contribution relative des miARN et des endo-siARN aux processus germinaux semble différer entre les organismes modèles. Malgré ces différences, Dicer est essentiel au développement embryonnaire chez le nématode, la drosophile, l'oursin, le poisson-zèbre et la souris (Grishok et al. 2001, Ketting et al. 2001, Knight and Bass 2001, Bernstein et al. 2003, Wienholds et al. 2003, Lee et al. 2004, Song et al. 2012, Drake et al. 2014).

Fait important, Dicer agit dans de nombreux processus en dehors de la biogenèse des petits ARN (Johanson et al. 2013, Kurzynska-Kokorniak et al. 2015). Par exemple, Dicer est impliqué dans la réponse aux dommages à l'ADN (Nakagawa et al. 2010) et a été trouvé dans le noyau, où il s'associe à la chromatine au niveau des loci d'ADN ribosomaux (Sinkkonen et al. 2010, Bernstein et al. 2012). Chez la drosophile, Dcr-2 est impliqué dans la régulation transcriptionnelle (Cernilogar et al. 2011) et peut se lier directement à la région 3 'non traduite de l'ARNm Toll, régulant l'expression et la signalisation des protéines Toll (Wang et al. 2015). Ainsi, l'importance de la contribution de Dicer aux processus liés à d’autres voies que celles des courts ARN non-codants et son impact sur la formation et la maintenance des cellules germinales reste à élucider.

Les miARN et les siARN inhibent l'expression génique post-transcriptionnelle en guidant une protéine Argonaute vers un ARNm-cible. Chez la souris, parmi les quatre Argonautes connus pour contribuer à la voie des miARN (Ago1-4), Ago2 est la seule Argonaute essentielle à la viabilité (Morita et al. 2007). La complémentarité parfaite entre le siARN et sa cible favorise le clivage endonucléolytique médié par Ago2, alors que les mésappariements dans la région centrale du miARN conduisent à une répression de l'expression génique indépendamment de l'activité catalytique de l'Argonaute.

Pour évaluer le rôle d'Ago2 dans l'ovogenèse chez la souris, Kaneda et collaborateurs ont supprimé Ago2 spécifiquement dans les oocytes en maturation (Kaneda et al. 2009). Ils ont

observé que les oocytes Ago2-/- ont des fuseaux de division et des chromosomes anormaux similaires à ceux des oocytes déficients en Dicer, ainsi qu'une expression réduite des miARN associée à une perturbation de l'expression génique. Ces résultats supportent le rôle d'Ago2 et des courts ARN qui y sont associés dans la régulation du transcriptome des oocytes murins. Cependant, il n'est pas clair si c’est l’altération de la fonction des miARN ou celle des endo-siARN, ou la combinaison des deux, qui provoquent une dérégulation de l'expression des gènes.

Stein et collaborateurs ont cherché à établir la fonction des endo-siARN durant l'oogenèse de la souris. Ils ont généré un mutant catalytique qui perturbe l'activité de clivage d’Ago2 spécifiquement dans les oocytes. Affecter l'activité catalytique d’Ago2 cause un problème de maturation méiotique et conduit à des changements importants du transcriptome des oocytes (Stein et al. 2015). Ces résultats révèlent que l’activité de clivage endonucléolytique d’Ago2 guidée par les endo-siARN est essentielle pendant la méiose I. Étant donné que les miARN n'utilisent pas l'activité de clivage d’Ago2 (excepté pour miR- 186/451 (Cheloufi et al. 2010, Cifuentes et al. 2010, Yang et al. 2010, Jee et al. 2018)), il est attendu que le mutant utilisé dans cette étude devrait nuire au fonctionnement des siARN sans affecter la répression médiée par les miARN. Étonnamment, ce n'était pas le cas puisque les niveaux de miARN et leur efficacité de répression traductionnelle étaient également affectés dans les oocytes immatures de ce mutant. Par conséquent, les miARN contribuent à la régulation de l'expression des gènes dans les oocytes immatures de la souris et nécessitent une Ago2 catalytiquement fonctionnelle. Toutefois, la capacité de certains miARN à réprimer des rapporteurs diminue durant la maturation des oocytes de souris. Par exemple, le miARN let-7 perd sa capacité à réguler la traduction d'un rapporteur durant la maturation des oocytes de souris (Ma et al. 2010). Au contraire, miR-30 conserve une partie de son activité et fonctionne sans affecter de manière significative le niveau d'ARNm du rapporteur (Ma et al. 2010). D'autres analyses transcriptomiques et analyses de rapporteurs in vivo suggèrent que les miARN n'affectent pas les niveaux d'ARNm cibles exprimés dans les oocytes matures (Suh et al. 2010). Chez Xenopus, l’activité des miARN semble aussi être réprimée durant la maturation des oocytes (Freimer et al. 2018). Ainsi, les miARN peuvent réguler l'expression des gènes dans les oocytes immatures de la souris,

et ce, par un mécanisme potentiellement indépendant de la dégradation des ARNm, mais leur activité semble perdre de son efficacité durant la maturation. Finalement, les contributions respectives des endo-siARN et des miARN à la régulation des cibles endogènes restent à déterminer.

Chez la drosophile, la voie des miARN dépend d’Ago1, tandis que la voie siARN dépend d’Ago2. Les mutants nuls Ago1 présentent des anomalies de la division des cellules germinales et de la formation des oocytes (Yang et al. 2007, Azzam et al. 2012). Inversement, les mutants Ago2 (déficience spécifique à la voie des siARN) sont viables et fertiles (Hain et al. 2010), bien que les embryons résultants présentent des défauts de migration nucléaire, de polarisation et de cellularisation (Deshpande et al. 2005), ainsi qu’une segmentation anormale (Lucchetta et al. 2009). Somme toute, ces résultats corrèlent avec ce qui est observé pour les mutants Dcr-1 et Dcr-2 : seuls les miARN semblent être essentiels pour l'oogenèse chez la drosophile. Cependant, il reste à déterminer si c’est leur contribution somatique ou germinale qui est importante. Chez C. elegans, la voie des miARN nécessite deux protéines Argonaute, ALG-1 et ALG-2, impliquées dans la régulation de la prolifération des cellules germinale (Bukhari et al. 2012). Les analyses phénotypiques des mutants alg-1(gk214) et alg-2(ok304) ont révélé un raccourcissement de la zone de prolifération mitotique, une transition précoce vers la méiose et un nombre significativement réduit d'oocytes (Bukhari et al. 2012). La perte des gènes alg-1 et alg-2 cause une létalité embryonnaire durant la phase de morphogénèse (Vasquez-Rifo et al. 2012). De façon surprenante, la perte de fonction d’alg-1 et alg-2 uniquement dans les cellules germinales ne cause pas de défaut majeur d’ovulation, mais cause tout de même une forte létalité embryonnaire (Rios et al. 2017). Ceci indique que les phénotypes germinaux observés sont majoritairement causés par la perte des miARN somatiques, et suggère que les miARN germinaux ne sont pas essentiels pour la maturation des oocytes et l’ovulation, mais sont requis après l’ovulation, durant le début de l’embryogénèse.

Dans l'ensemble, l'étude des phénotypes causés par la perte de fonction des facteurs clés associés aux voies des courts ARN a été utile pour mieux comprendre leur rôle dans la lignée germinale des animaux. Cependant, l'implication de plusieurs de ces facteurs dans

d'autres voies moléculaires, incluant la voie des endo-siARN, rend plutôt difficile de déchiffrer la contribution relative de chacune des voies aux processus germinaux et embryonnaires. De plus, les phénotypes observés lors d’une perte de fonction spécifique aux cellules germinales sont souvent moins sévères que ceux causés par une perte de fonction dans tous les tissus. Ceci indique que les courts ARN des cellules somatiques peuvent contribuer aux phénotypes germinaux observés, ce qui doit absolument être pris en compte lors de l’interprétation des résultats.