5. La protéine DSCAM (molécule d’adhésion cellulaire associée au syndrome de Down)
5.3 Perte de fonction de DSCAM
5.3.1 Rôles de DSCAM dans le développement des réseaux neuraux 5.3.1.1 DSCAM et organisation des neurones en réseaux DSCAM et circuits neuronaux chez la drosophile
La grande diversité moléculaire générée par l’épissage alternatif des gènes Dscam de la drosophile, combinée aux caractéristiques moléculaires de cette protéine, confère aux DSCAMs un rôle dans l’organisation topographique espacée des neurones, en réseaux (Schmucker et al., 2000, Chen et al., 2006a, Hattori et al., 2007). En effet, la réduction de la diversité des isoformes de Dscam1 suffit à entraîner des défauts dans la mise en place des circuits neuronaux de la drosophile (Chen et al., 2006a). Un tel arrangement des neurones en réseaux nécessite une organisation précise des neurites de tous les types de neurones localisés dans une même région, ce qui dépend de deux mécanismes faisant intervenir les DSCAMs (Figure 0.8). D’une part, l’auto-évitement des neurites d’un même neurone permet d’empêcher que celles-ci ne soient fasciculées ou ne s’entrecroisent, assurant une dispersion maximale de l’arbre
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dendritique et l’intégration efficace des signaux synaptiques (Kramer and Kuwada, 1983, Jan and Jan, 2003). D’autre part, l’auto-évitement des neurites de neurones voisins de même type cellulaire, rapporté pour la première fois pour les cellules ganglionnaires de la rétine (Wassle et al., 1981, Perry and Linden, 1982), permet aux neurones de même type cellulaire de couvrir un champ dendritique maximal, sans redondance. Au contraire, des neurones voisins de différents types cellulaires ont souvent des champs dendritiques superposés, permettant l’intégration des différents aspects du signal, comme les différentes classes de cellules ganglionnaires qui répondent sélectivement aux mouvements selon leur direction (Amthor and Oyster, 1995). Ces deux phénomènes d’auto-évitement dépendent des DSCAMs.
En effet, seules deux isoformes identiques peuvent créer entre elles des liaisons, dites alors homophiles, via leurs domaines extracellulaires (Wojtowicz et al., 2004, Wojtowicz et al., 2007). Or, chaque neurone exprime une combinaison unique de 14 à 50 isoformes de Dscam1 (Neves et al., 2004), créant ainsi une sorte de signature à la surface membranaire de la cellule. Cette signature forme la base moléculaire du principe d’auto-évitement par lequel les neurites d’un même neurone se reconnaissent et se repoussent mutuellement, assurant ainsi un bon développement de l’arborisation dendritique (Hughes et al., 2007, Matthews et al., 2007, Soba et al., 2007) et axonale (Wang et al., 2002, Zhan et al., 2004, Hattori et al., 2007) des neurones. En effet, la liaison homophile de deux isoformes entraîne l’activation du domaine cytoplasmique, induisant une cascade de signalisation qui conduit à la répulsion via la modification des protéines du cytosquelette (Hughes et al., 2007, Matthews et al., 2007).
L’organisation topographique espacée de neurones voisins, de même type cellulaire, peut s’expliquer par un processus similaire, dépendant des autres gènes Dscam de la drosophile (Dscam2, 3 et 4). En effet, puisque chaque neurone exprime une combinaison unique d’isoformes, Dscam1 ne semble pas être responsable de la reconnaissance de deux neurones voisins. Ce qui explique d’ailleurs pourquoi la mutation de Dscam1 affecte la capacité des neurones de la drosophile à reconnaître leurs propres dendrites, qui se retrouvent alors fasciculées et entrecroisées, sans affecter leur capacité à reconnaître les dendrites des neurones voisins de même type cellulaire (Hughes et al., 2007, Matthews et al., 2007, Soba et al., 2007). Cependant, l’expression spécifique de l’un des autres gènes Dscam, qui ne sont pas soumis à un intensif épissage alternatif, permet cette reconnaissance. Par exemple, Dscam2 est nécessaire à la reconnaissance entre eux d’un sous-type de neurones du système visuel de la drosophile qui, en l’absence de Dscam2, perdent leur organisation topographique spécifique (Millard et al., 2007).
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Figure 0.8: DSCAM et le principe d’auto-évitement des dendrites d’un même neurone ou de neurones voisins. (A) Représentation schématique des principes selon lesquels les dendrites d’un même neurone, ainsi que celle de neurones voisins s’évitent mutuellement. (B) Un défaut d’auto-évitement des dendrites d’un même neurone induit leur fasciculation. (C) Un défaut d’auto-évitement des dendrites de neurones voisins entraîne une superposition des de leurs champs dendritiques. (Adapté de Montesinos 2014).
DSCAM et circuits neuronaux chez le vertébré
Bien que les DSCAMs des vertébrés montrent peu (DSCAML1) ou pas (DSCAM) de variabilité du domaine extracellulaire (Agarwala et al., 2001b, Barlow et al., 2002), une certaine conservation fonctionnelle existe entre les DSCAMs des vertébrés et de la drosophile, puisque DSCAM et DSCAML1 permettent l’adhésion cellulaire via des interactions homophiles (Agarwala et al., 2001a, Agarwala et al., 2001b). De plus, aucune adhésion cellulaire ne se forme entre une cellule transfectée avec DSCAM et une cellule transfectée avec DSCAML1, indiquant que les DSCAMs des vertébrés ne réalisent pas d’interaction hétérophile (Yamagata and Sanes, 2008), comme c’est le cas des DSCAMs de la drosophile (Wojtowicz et al., 2004). Ces dernières années, la caractérisation de cinq mutants murins de DSCAM (DSCAMdel17, DSCAMtm1.1Kzy,
DSCAM2J, DSCAM3J, et DSCAMGOF) a permis d’étudier différents rôle des DSCAMs des vertébrés, résumés
dans le tableau 2.
Alors que la mutation GOF est une mutation conditionnelle gain de fonction (Li et al.,2015), et que la mutation tm1.1Kzy est une ablation génétique ciblée de DSCAM (Amano et al., 2009), les mutations del17,
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2J et 3J sont des mutations spontanées de DSCAM,qui génèrent une protéine non fonctionnelle, tronquée respectivement au niveau du deuxième domaine fibronectine (DSCAMdel17; (Fuerst et al., 2008)), et à la
moitié du domaine extracellulaire (DSCAM2J; (Fuerst et al., 2010)).En plus de phénotypes mutants très
marqués, les différents mutants de DSCAM présentent tous une importante désorganisation des neurones de la rétine (Fuerst et al., 2008, Fuerst et al., 2010, Fuerst et al., 2012, Schramm et al., 2012). L’organisation complexe, à la fois horizontale (en couches) et verticale (en colonnes), des neurones de la rétine en fait une région de choix pour l’étude des principes d’organisation topographique des neurones. DSCAM est normalement exprimée dans deux types de cellules de la rétine : les cellules ganglionnaires positives à la mélanopsine (MRGCs) et les cellules amacrines dopaminergiques (DACs) (Fuerst et al., 2008, Fuerst et al., 2009). À la suite d’une perte de fonction du gène DSCAM, les corps cellulaires de ces neurones sont positionnés plus près les uns des autres, et leurs dendrites qui sont normalement séparées, formant un arbre dendritique, se retrouvent fasciculées, formant des faisceaux dans la rétine des mutants de DSCAM. Dans la rétine de la souris, DSCAML1 présente un patron d’expression distinct de celui de DSCAM puisqu’elle est exprimée dans les cellules bipolaires (RBCs) et dans les cellules amacrines de type AII. La perte de fonction du gène DSCAML1 induit une fasciculation des dendrites et l’agrégation des corps cellulaires de ces neurones, qui perdent donc leur organisation topographique espacée (Fuerst et al., 2009). L’analyse des différents types de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGCs) dans la rétine de souris mutée pour DSCAM a permis l’élaboration d’un modèle pour expliquer comment les DSCAMs des vertébrés participent à ces phénomènes d’auto-évitement alors qu’elles montrent très peu de variabilité de leur domaine extracellulaire (Fuerst et al., 2009). En effet, l’utilisation de marqueurs spécifiques des différents types de RGCs a permis de montrer que la mutation de DSCAM induit une fasciculation des dendrites et une agrégation cellulaire de toutes les RGCs, sans qu’aucun des amas cellulaires formés ne regroupe différents types de RGCs. Ces données suggèrent que DSCAM induirait une répulsion cellulaire en masquant d’autres molécules d’adhérences spécifiques des différents types cellulaires. Ces molécules provoqueraient ainsi l’agrégation des cellules de même type lorsque DSCAM est absente. Les protocadhérines pourraient être une de ces molécules masquées par DSCAM puisque ce sont des molécules d’adhérence cellulaire exprimées de manière aléatoire et combinatoire par chaque neurone (Kohmura et al., 1998, Wu and Maniatis, 1999, Schreiner and Weiner, 2010) et impliquées dans l’auto- évitement des neurites dans les cellules de Purkinje de la rétine et du cervelet de la souris (Lefebvre et al., 2012).
Le rôle de DSCAM, DSCAML1 et des protéines Sidekick (de structure proche des DSCAMs, avec des domaines d’immunoglobuline et fibronectine de type III) a également été étudié dans la rétine du poulet, où les cellules amacrines et bipolaires font synapses sur les dendrites des RGCs, dans la couche plexiforme
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interne (en anglais, internal plexiform layer; IPL), elle-même organisée en différentes sous-couches (Yamagata and Sanes, 2008). Comme dans la rétine de la souris, les protéines DSCAM, DSCAML1 et Sidekick (appelées molécules d’adhésion de la superfamille des immunoglobulines; IgSF) sont exprimées selon des patrons distincts, dans différents types de cellules. Les éléments pré- et post-synaptiques formant une synapse dans la couche IPL expriment la même combinaison d’IgSF, et la mutation de l’une de ces IgSF suffit à empêcher la formation de ces synapses spécifiquement dans la couche IPL, suggérant un rôle des protéines DSCAM, DSCAML1 et Sidekick dans la formation organisée des synapses via des liaisons homophiles (Yamagata and Sanes, 2008). Ainsi, dans le contexte approprié, DSCAM semble également pouvoir induire l’adhésion cellulaire. Un rôle similaire de DSCAM a également été décrit dans la souris mutante DSCAM2J, où la mutation de DSCAM induit des défauts de formation des différentes couches de la
rétine (Fuerst et al., 2010).
5.3.1.2 DSCAM et guidage axonal
DSCAM et le guidage axonal chez la drosophile
En plus de leurs rôles dans l’organisation topographique des neurones, les DSCAMs de la drosophile semblent impliquées dans le guidage axonal des neurones en développement. Comme décrit précédemment, un certain nombre de molécules, dont le complexe Nétrine/DCC, permettent de guider les axones en croissance afin que ceux-ci atteignent la ou les bonne(s) cible(s) (Tessier-Lavigne and Goodman, 1996). La mutation d’une de ces molécules de guidage axonal conduit à des défauts d’organisation des projections axonales. De manière similaire, la mutation de DSCAM entraîne d’importants défauts dans la projection axonale des neurones récepteurs olfactifs (Hummel et al., 2003) et des neurones commissuraux (Schmucker et al., 2000, Andrews et al., 2008) de la drosophile. En effet, DSCAM est exprimée dans les axones des neurones commissuraux de la drosophile pendant le développement embryonnaire, et son absence entraîne une diminution du nombre d’axones croisant la ligne médiane (Schmucker et al., 2000, Andrews et al., 2008), alors que sa surexpression suffit à l’augmenter (Andrews et al., 2008). De plus, DSCAM se lie à Netrine-1, qui est sécrété par la ligne médiane de la moelle épinière embryonnaire, suggérant un rôle de DSCAM comme un récepteur attracteur pour Netrin-1 (Andrews et al., 2008).
DSCAM et le guidage axonal chez le mammifère
Alors que l’ensemble des études menées à ce jour sur les DSCAMs de la drosophile confirment leur rôle dans le guidage axonal, ce rôle reste controversé pour les DSCAMs des vertébrés. En effet, DSCAM peut
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se lier à Nétrine-1 (Andrews et al., 2008), et à DCC (Ly et al., 2008), et l’inhibition de son expression, par introduction de petits ARN interférents (en anglais, smaill interfering RNA; siRNA) dans les embryons de poulet ou de souris en culture, entraîne des défauts de croissance et de guidage des axones commissuraux (Ly et al., 2008, Liu et al., 2009). Au contraire, l’ablation génétique de DSCAM in vivo n’entraîne pas de diminution de croissance ou de décussation des axones commissuraux (Palmesino et al., 2012). La variabilité des phénotypes décrits dans ces différentes études pourrait être liée aux différentes techniques utilisées pour inhiber l’expression de DSCAM. En effet, l’ablation génétique de DSCAM, sur le long terme, pourrait donner à l’organisme un temps suffisant pour la mise en place d’effets compensatoires qui n’ont pas lieu dans le cas d’une inhibition aiguë de l’expression de la protéine par siRNA, comme cela a déjà été discuté pour d’autres protéines (Moore and Kennedy, 2006, Wu et al., 2006). Par exemple, étant donné le rôle de DSCAM dans la mort cellulaire (Li et al., 2015), l’ablation génétique de DSCAM pourrait entraîner une augmentation de la survie cellulaire qui pourrait compenser la diminution du nombre de neurones commissuraux observée après inhibition du gène par siRNA (Palmesino et al., 2012).
Compliquant encore l’interprétation de ces résultats, DSCAM semble également impliquée dans la répulsion axonale induite par Nétrine-1 dans certains contextes (Purohit et al., 2012). En effet, Nétrine-1 qui induit l’attraction des axones des neurones exprimant le récepteur DCC, induit la répulsion lorsque les domaines cytoplasmiques de DCC et UNC5 interagissent (Hong et al., 1999), permettant ainsi que les axones commissuraux ne croisent qu’une seule fois la ligne médiane. Or, DSCAM et UNC5 interagissent par leurs domaines extracellulaires et l’ablation génétique de l’une ou de l’autre de ces protéines inhibe la répulsion axonale induite par Nétrine-1 dans les cellules granulaires du cervelet (Purohit et al., 2012). DSCAM interagit également avec Draxine, une molécule de guidage qui induit la répulsion des axones commissuraux du cerveau et de la moelle épinière (Islam et al., 2009), et qui régule la croissance des neurones corticaux et des neurones du bulbe olfactif (Ahmed et al., 2011).
Ainsi, la protéine DSCAM des vertébrés semble pouvoir interagir de manière hétérophile avec un certain nombre de molécules impliquées dans le guidage axonal, induisant l’attraction ou la répulsion des axones selon le contexte. Cependant, son rôle dans le guidage axonal des interneurones commissuraux de la moelle épinière reste à préciser.
5.3.2 Conséquences fonctionnelles de la mutation de DSCAM
L’ensemble des études décrites dans les sections précédentes ont surtout évalué les conséquences d‘une dérégulation de l’expression de DSCAM sur différents aspects de l’anatomie du système nerveux, tels que l’organisation topographique des neurones, la croissance et le guidage dendritiques et axonaux, la survie
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cellulaire. Cependant, comme le suggèrent les études associant une surexpression de DSCAM avec plusieurs maladies du système nerveux, ces changements anatomiques développementaux pourraient induire des changements fonctionnels, qui n’ont été que très peu étudiés à ce jour.
Ce n’est que récemment qu’une étude a révélé pour la première fois un rôle fonctionnel de DSCAM, suggérant son implication dans le fonctionnement du circuit moteur spinal contrôlant la respiration (Amano et al., 2009). En effet, les souris DSCAMtm1.1Kzy (DSCAM-knockout) présentent des défauts dans la
génération du rythme respiratoire, caractérisés par la perte de la coordination unilatérale et bilatérale de l’activité des neurones pré-inspiratoires. Ainsi, en l’absence de DSCAM, l’activité de la racine ventrale C4, contrôlant la contraction du diaphragme, présente un rythme de contraction irrégulier et de fréquentes apnées pouvant entraîner une mort néonatale (Amano et al., 2009).
Une autre étude a par ailleurs révélé un rôle de DSCAM dans la transmission synaptique. Chez l’aplysie, l’inhibition de DSCAM, par introduction de siRNA, bloque la transmission synaptique en empêchant la réorganisation des récepteurs glutamatergiques de type AMPA à la membrane postsynaptique (Li et al., 2009). En effet, lors de la formation d’une nouvelle synapse, l’accumulation transitoire de DSCAM à la membrane de l’élément présynaptique entraîne le recrutement de récepteurs glutamatergiques de type AMPA à la membrane postsynaptique. Cette accumulation de DSCAM à la membrane présynaptique est par ailleurs stabilisée par la présence de DSCAM à la membrane de l’élément postsynaptique (Li et al., 2009), permettant ainsi de stabiliser la synapse grâce à des liaisons homophiles, comme décrit pour la drosophile (Cvetkovska et al., 2013, Kim et al., 2013) et la souris (Yamagata and Sanes, 2008). De plus, les DSCAMs de drosophile sont impliquées dans le développement normal de l’arborisation dendritique des motoneurones et dans la régulation de la densité et de la taille des éléments présynaptiques des axones sensoriels sur les motoneurones (Kim et al., 2013). L’ensemble de ces résultats suggère donc un rôle de DSCAM aux niveaux pré- et post-synaptiques dans l’établissement et la stabilisation de la synapse sensorimotrice.
Depuis, l’étude des souris DSCAMdel17 a révélé un potentiel rôle de DSCAM dans le fonctionnement des
circuits neuronaux contrôlant la posture et la motricité (Xu et al., 2011). En effet, les souris DSCAMdel17
présentent des problèmes posturaux caractérisés par une dystonie axiale et une hyperextension des membres, accompagnés de déficits d’endurance et de coordination motrice. Ces défauts fonctionnels sont accompagnés d’une hydrocéphalie sévère, avec effondrement du cortex et amincissement de la couche corticale (Xu et al., 2011). Contrairement aux souris DSCAMtm1.1Kzy et DSCAMdel17, qui meurent rapidement
après la naissance (Fuerst et al., 2008, Amano et al., 2009), les souris DSCAM2J survivent jusqu’à l’âge
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Ainsi, nous avons observé dans notre laboratoire que les souris DSCAM2J adultes présentent des défauts
posturaux semblables à ceux des souris DSCAMdel17, ainsi que des défauts de locomotion lorsqu’on les fait
marcher sur un tapis roulant (Lemieux et al., 2016b). En effet, les souris DSCAM2J présentent des défauts
du rythme locomoteur, caractérisés par une augmentation de la durée de la phase de balancement, ainsi que des défauts de coordination bilatérale des membres. Par ailleurs, les souris Dscam2J présentent une
hydrocéphalie moins sévère que les souris DSCAMdel17, sans effondrement du cortex. Ces résultats
suggèrent que l’hydrocéphalie n’est pas la seule explication pour les défauts posturaux et locomoteurs observés chez les souris mutantes pour DSCAM.
Tableau 2: Les différents modèles murins de mutations de DSCAM étudiés à ce jour. (Adapté de Montesinos 2014).
Mutation DSCAMdel17 DSCAMtm1.1Kzy DSCAM2J DSCAM3J DSCAMGOF
Production
Spontanée
(délétion de 38 pb entrainant la formation d'une protéine tronquée au 2ème domaine fibronectine)
Délétion génétique du premier exon
Spontanée
(duplication de 4 pb entrainant la formation d'une protéine tronquée environ à la moitié du domaine extracellulaire)
Spontanée
(substitution d'un nucléotide, sans effet sur la taille de la protéine détectée par Western blot)
Mutation gain de fonction conditionnelle
Viabilité
Fond génétique C57BL/6J: mort périnatale Fond génétique mixte: viable
Fond génétique C57BL/6J: mort périnatale Fond génétique mixte: viable
Viable (même sur le fond génétique C3H, où la mutation est apparue)
Viable Viable
Auto-évitement des dendrites
Affecté (fasciculation des dendrites et rapprochement
des corps cellulaires)
Non déterminé
Affecté (fasciculation des dendrites et rapprochement des
corps cellulaires)
Moins affectée que DSCAM2J
(mais occasionnels fasciculation des dendrites et rapprochement des corps cellulaires)
Normal
Lamination synaptique dans la rétine
Normale Non déterminé Affectée Normale Normale
Mort cellulaire programmée (rétine)
Affectée (augmentation de la
survie cellulaire) Non déterminé
Affectée (augmentation du nombre de cellules) Affectée (augmentation du nombre de cellules) Augmentation de la mort cellulaire programmée Croissance et guidage axonal
Défauts de ségrégation des projections rétinogéniculées
Pas de défaut des axones commissuraux des neurones de la moelle épinière
Non déterminé Non déterminé Non déterminé
Posture Dystonie axiale, hyperextension des membres _ Dystonie axiale, hyperextension des membres Normale Normale
Coordination et endurance motrices
Affectées (moins bons résultats
aux tests sur rotarod) Non déterminé
Défauts de coordination bilatérale des membres (locomotion sur tapis roulant)
Non déterminé Non déterminé
Autres phénotypes
Hydrocéphalie sévère, malformation du cortex, du corps calleux et des fibres moussues
Défauts du circuit spinal cervical entrainant des défauts dans la génération du rythme respiratoire
Hydrocéphalie (moins sévère que DSCAMdel17)
Hydrocéphalie, rigidité
musculaire _
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Problématique et objectifs des travaux
Alors que DSCAM est exprimée dans la moelle épinière pendant le développement embryonnaire, qu’il existe une abondante littérature sur ses implications dans les mécanismes de développement du système nerveux, et que les souris mutantes pour DSCAM présentent de sévères défauts posturaux et moteurs, il n’y a aucune information sur le rôle de DSCAM dans la mise en place du circuit spinal lombaire contrôlant la locomotion. Notre hypothèse générale est que DSCAM est impliquée dans le développement et/ou le maintien du circuit locomoteur spinal. Pour répondre à notre hypothèse, nous utilisons des techniques électrophysiologiques et anatomiques, afin d’évaluer le circuit locomoteur spinal de souris mutantes pour DSCAM. Dans un premier temps, les souris portant la mutation systémique DSCAM2J nous permettent
d’évaluer la fonctionnalité du circuit locomoteur spinal en l’absence de DSCAM. Dans un second temps, l’étude du répertoire locomoteur des souris DSCAM2J nous permet d’évaluer la fonctionnalité des circuits
contrôlant la coordination des membres pendant la locomotion en l’absence de DSCAM. Enfin, la mutation conditionnelle de DSCAM dans les interneurones excitateurs ou inhibiteurs nous permet d’identifier et de caractériser la contribution des populations interneuronales spinales affectées par la mutation de DSCAM.