L’activité locomotrice serait initiée à la suite de l’activation d’interneurones spinaux excitateurs formant des projections axonales ipsilatérales. En effet, une activité rythmique peut être engendrée à la suite de l’augmentation de l’excitabilité du réseau (Bracci et al., 1998, Whelan et al., 2000), ou de l’activation spécifique des neurones glutamatergiques (Hagglund et al., 2010, Talpalar and Kiehn, 2010). De plus, des études pharmacologiques ont montré que l’activité rythmique persiste en absence de la transmission synaptique inhibitrice (Bracci et al., 1996), ainsi qu’à la suite d’une hémi-lésion (Kjaerulff and Kiehn, 1996, Bonnot and Morin, 1998, Whelan et al., 2000). Cependant, la coordination entre la gauche et la droite est maintenue uniquement en présence de la commissure ventrale (Kjaerulff and Kiehn, 1996), confirmant l’implication d’interneurones commissuraux dans la coordination bilatérale. De plus, l’ajout d’antagonistes glycinergiques et GABAergiques dans la solution de liquide céphalorachidien artificielle perfusant la moelle épinière isolée de rat nouveau-né induit une activité rythmique avec une synchronisation bilatérale, confirmant la nature principalement inhibitrice des connexions établies par ces interneurones commissuraux (Bracci et al., 1996).
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Plusieurs populations d’interneurones spinaux excitateurs et inhibiteurs impliquées dans l’activité locomotrice ont été identifiées sur la base de leurs propriétés membranaires, de leur connectivité et de leur patron d’activité (pour revue, Kiehn 2006). Mais c’est surtout au cours de ces 20 dernières années que de nouvelles approches expérimentales, combinant outils génétiques et moléculaires, ont permis l’identification de différents types d’interneurones spinaux et la caractérisation de leurs rôles au sein des CPGs locomoteurs des mammifères (Jessell, 2000, Lee and Pfaff, 2001, Lanuza et al., 2004, Gosgnach et al., 2006, Zhang et al., 2008, Goulding, 2009, Garcia-Campmany et al., 2010, Gosgnach, 2011, Talpalar et al., 2013, Zhang et al., 2014).
Pendant le développement embryonnaire, différents types de cellules sont générés le long de l’axe dorso- ventral du tube neural., Très tôt au cours du développement, l’action de différentes molécules sécrétées le long de la ligne médiane conduit à la subdivision spatiale dorso-ventrale de domaines progéniteurs qui acquièrent l’expression de différentes combinaisons de facteurs de transcription (pour revue, Jessell 2000). Selon les facteurs de transcriptions qu’elles expriment, les cellules du tube neural se divisent en 11 populations distinctes (dI1-dI6, V0-V3, VMN) qui peuvent être observées dès le 10ème jour embryonnaire
(E10) chez la souris, puis en 23 sous-populations (Figure 0.6). Le profil d’expression de facteurs de transcription détermine l’identité cellulaire (Bang and Goulding, 1996, Goulding and Lamar, 2000, Goulding and Pfaff, 2005), le patron de projection axonale (Betley et al., 2009) et le type de neurotransmetteurs exprimés (Cheng et al., 2005, Mizuguchi et al., 2006, Pillai et al., 2007). Les neurones partageant le même profil d’expression de facteurs de transcription partagent donc potentiellement les mêmes caractéristiques et le même rôle fonctionnel dans la locomotion. Grâce aux outils génétiques modernes, il est possible de générer des souris dans lesquelles une population neuronale spécifique peut être ciblée, grâce aux facteurs de transcription qu’elle exprime, afin de la visualiser par l’expression de protéines fluorescentes, de la stimuler, de l’inhiber ou de la détruire. Ces manipulations génétiques nous permettent ainsi d’étudier l’implication de populations neuronales identifiées génétiquement dans le contrôle moteur et locomoteur. Ainsi, de nombreuses études associant des techniques de génétique moléculaire, d’électrophysiologie et de traçage anatomique ont permis d’identifier 6 populations d’interneurones spinaux (dI6, V0, V1, V2, V3 et Hb9) susceptibles de jouer un rôle clef dans l’activité locomotrice.
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Figure 0.6 : Détermination de l’identité neuronale des populations neuronales spinales. Représentation schématique des étapes de la détermination génétique de l’identité cellulaire des populations neuronales spinales. La progression développementale, depuis les domaines progéniteurs jusqu’aux neurones post-mitotiques, est représentée de gauche à droite. (Adapté de Alaynick et al., 2011).
3.1 Les interneurones dI6
Les interneurones dl6 expriment les facteurs de transcriptions Lbx1 (Gross et al., 2002) et WT1 (Goulding, 2009) et sont localisées dans la lamina VII/VIII de la moelle épinière (Gross et al., 2002). Cette population neuronale est composée de neurones inhibiteurs ipsilatéraux et commissuraux (Goulding, 2009, Rabe et al., 2009), dont la plupart ont une activité rythmique pendant la locomotion fictive (Dyck et al., 2012). Sur la base de leurs propriétés électrophysiologiques intrinsèques (propriétés membranaires et patrons de décharge), les neurones dI6 peuvent être divisés en deux populations (Dyck et al., 2012). L’une présente des bouffées de potentiels d’action faiblement coordonnées à l’activité ENG des racines ventrales pendant un épisode de locomotion fictive. Cependant, ces neurones montrent des propriétés membranaires intrinsèques similaires à celles des neurones oscillants, suggérant une implication dans l’initiation du rythme locomoteur. La seconde population de neurones présente un patron de décharge rythmique en phase avec
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l’activité ENG des racines ventrales, mais ne possède aucune des propriétés membranaires caractéristiques des neurones oscillants.
Plus récemment, Dmrt3 a été identifié comme un nouveau marqueur d’une sous-population des interneurones dI6 (Andersson et al., 2012, Vallstedt and Kullander, 2013). Les interneurones Dmrt3 sont inhibiteurs et des expériences de traçage anatomique rétrograde ont révélé des projections directes sur les motoneurones ipsilatéraux et controlatéraux au muscle injecté (Vallstedt and Kullander, 2013). De manière intéressante, certains chevaux portant une mutation spontanée de Dmrt3 présentent un comportement locomoteur spécifique, avec l’apparition du pas amble, type de démarche caractérisé par la synchronisation latérale des membres avants et arrières (Andersson et al., 2012). La mutation Dmrt3-/- affecte aussi la
locomotion fictive néonatale des souris, qui est caractérisée par un rythme irrégulier et une mauvaise coordination des activités ENG des racines ventrales homolatérales reliées aux fléchisseurs et aux extenseurs, ainsi que des racines ventrales gauche et droite d’un même segment spinal (Andersson et al., 2012, Vallstedt and Kullander, 2013). Ces défauts fonctionnels sont accompagnés par une augmentation du nombre de neurones WT1 et une diminution du nombre d’interneurones commissuraux dans la moelle épinière des souris mutantes Dmrt3-/- (Andersson et al., 2012, Vallstedt and Kullander, 2013). Bien que ces
défauts anatomiques et fonctionnels du circuit locomoteur spinal résultent probablement de changements de l’identité développementale des interneurones dI6, l’étendue de la réorganisation du réseau spinal de ces mutants reste inconnue. Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggère que les interneurones dl6 pourraient être une composante du circuit locomoteur spinal dont le rôle précis reste à élucider.
3.2 Les interneurones V0
La population d’interneurones V0 est localisée dans la partie ventro-médiane de tous les segments de la moelle épinière (Pierani et al., 1999) et est constituée d’environ deux tiers de neurones inhibiteurs et d’un tiers de neurones excitateurs (Lanuza et al., 2004). Les neurones V0 expriment le facteur de transcription Dbx1 et sont répartis en deux sous-populations d’interneurones commissuraux: les neurones V0V expriment
le facteur de transcription Evx1 et sont localisés plus ventralement, alors que les neurones V0D n’expriment
pas Evx1 et sont plus dorsaux (Moran-Rivard et al., 2001, Pierani et al., 2001). Cependant, un troisième groupe de neurones, exprimant le facteur de transcription Pitx2, a également été mis en évidence. Cette sous-population, appelée V0C/G, est constituée de neurones excitateurs (soit glutamatergiques (V0G) soit
cholinergiques (V0C)) qui projettent ipsilatéralement sur les motoneurones (Zagoraiou et al., 2009). Les
neurones V0C sont la seule source de contacts synaptiques cholinergiques (boutons C) sur les
motoneurones, et ils présentent un patron de décharge rythmique en phase avec l’activité ENG des racines ventrales pendant la locomotion fictive (Zagoraiou et al., 2009). L’absence des trois sous-populations de
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neurones V0 dans les souris mutantes Dbx1-/- entraîne une synchronisation des activités des racines
ventrales gauche et droite d’un même segment spinal lors de la locomotion fictive néonatale, alors que l’alternance homolatérale fléchisseur-extenseur est conservée (Lanuza et al., 2004). L’ensemble de ces données suggère que les neurones V0 sont une composante du CPG locomoteur spinal, notamment impliqués dans le contrôle de l’alternance bilatérale lors de la locomotion. Plus récemment, des expériences d’ablation génétique spécifique des interneurones V0V et/ou V0D suggèrent que l’’implication de ces
différentes sous-populations dans le contrôle de la coordination bilatérale est dépendante de la fréquence locomotrice (Talpalar et al., 2013). Les interneurones inhibiteurs V0D seraient recrutés à basse vitesse,
conduisant à l’alternance bilatérale caractéristique de la marche, alors que les interneurones excitateurs V0V semblent nécessaires à la coordination gauche-droite à haute vitesse. De plus, des études ont montré
qu’un sous-groupe d’interneurones V0D, situés latéralement au canal central, reçoivent des projections des
afférences primaires, projettent sur des motoneurones controlatéraux et sont rythmiquement actifs pendant un épisode de locomotion fictive (Griener et al., 2015). D’après ces données, ce sous-groupe d’interneurones V0D pourrait être responsable du contrôle de la coordination bilatérale nécessaire à la
locomotion.
3.3 Les interneurones V1
Les interneurones V1 expriment le facteur de transcription En1 et sont localisés dans la lamina VII (Burrill et al., 1997, Saueressig et al., 1999). Cette population neuronale est constituée d’interneurones inhibiteurs qui projettent ipsilatéralement sur les motoneurones des segments voisins (Saueressig et al., 1999, Sapir et al., 2004, Betley et al., 2009, Zhang et al., 2014), et qui incluent notamment les interneurones de type Ia (IaINs; (Alvarez et al., 2005)) impliqués dans l’inhibition réciproque entre groupes de motoneurones antagonistes (fléchisseur-extenseur) (Eccles et al., 1956, Feldman and Orlovsky, 1975), et les cellules de Renshaw, impliquées dans l’inhibition récurrente des motoneurones (Sapir et al., 2004). Cependant, l’inhibition réciproque est préservée en l’absence des interneurones V1 (Wang et al., 2008). De plus, bien que le rythme locomoteur soit ralenti de façon significative pendant la locomotion fictive néonatale des moelles épinières mutantes pour V1 (Sapir et al., 2004, Gosgnach et al., 2006), celles-ci présentent une bonne coordination fléchisseur-extenseur, même après une hémisection sectionnant toutes les connections commissurales (Zhang et al., 2014). L’ensemble de cesrésultats suggère que les neurones V1 sont une composante du CPG locomoteur spinal qui pourrait participer au maintien de l’inhibition réciproque et du rythme locomoteur, en collaboration avec d’autres populations interneuronales spinales.
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3.4 Les interneurones V2
La population interneuronale V2, localisée dans la lamina VII de la moelle épinière, est constituée de deux principales sous-populations dont les projections sont ipsilatérales. Les interneurones V2a, qui expriment les facteurs de transcription Lhx3 et Chx10, sont des interneurones excitateurs, alors que les V2b, qui expriment les facteurs de transcription Gata2 et Gata3, sont inhibiteurs (Karunaratne et al., 2002, Smith et al., 2002, Al-Mosawie et al., 2007, Lundfald et al., 2007, Peng et al., 2007, Dougherty and Kiehn, 2010). L’ablation génétique des interneurones V2a affecte l’activité ENG enregistrée pendant la locomotion fictive néonatale, augmentant la variabilité de l’amplitude des bouffées ENG et de la durée du cycle de locomotion fictive, et altérant la coordination gauche-droite, sans perturber la coordination fléchisseur-extenseur (Crone et al., 2008). Ces défauts fonctionnels suggèrent l’implication des interneurones V2a dans le contrôle de la coordination bilatérale pendant la locomotion. Confirmant cette hypothèse, des expériences de traçage anatomique ont montré que les interneurones V2a projettent ipsilatéralement sur les interneurones commissuraux V0V (Crone et al., 2008), qui sont eux-mêmes nécessaires à l’alternance gauche-droite
(Lanuza et al., 2004). Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggère l’implication d’au moins deux composantes (V0 et V2a) dans le contrôle de la coordination bilatérale lors de la locomotion. De façon intéressante, les souris adultes dans lesquelles les interneurones V2a ont été détruits présentent des défauts dans la coordination gauche-droite uniquement lors d’épisodes rapides de locomotion sur tapis roulant, ce qui se traduit par l’absence de galop et l’émergence d’une synchronisation des membres postérieurs à haute vitesse de marche, contrairement aux souris contrôles (Crone et al., 2009). De plus, la plupart des interneurones V2a possèdent des propriétés membranaires intrinsèques similaires à celles des neurones oscillants (Dougherty and Kiehn, 2010, Zhong et al., 2010), et la proportion d’interneurones V2a rythmiquement actifs lors d’épisodes de locomotion fictive augmente avec la fréquence locomotrice (Zhong et al., 2010). Ainsi, bien que la locomotion soit maintenue en l’absence des neurones V2a, indiquant que cette population neuronale n’est pas à elle seule suffisante pour générer le rythme locomoteur, l’ensemble des résultats obtenus in vitro et in vivo suggère que les neurones V2a constituent un élément important du circuit locomoteur spinal.
Plus récemment, une étude a montré pour la première fois que des interneurones V2b, comme les V1 possèdent les caractéristiques anatomiques des interneurones Ia (Zhang et al., 2014). Par ailleurs, l’inactivation génétique de la transmission inhibitrice des interneurones V2b induit une augmentation de la variabilité de la coordination homolatérale fléchisseur-extenseur, sans affecter l’alternance gauche-droite des moelles épinières (Zhang et al., 2014). Lorsqu’une hémisection est réalisée le long de la ligne médiane, en plus de cette inactivation génétique des V2b, la majorité (13/20) des moelles épinières présentent une
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synchronisation des activités ENG reliées aux extenseurs et aux fléchisseurs (Zhang et al., 2014). Cependant, le fait que l’alternance homolatérale fléchisseur-extenseur soit conservée dans certaines de ces moelles épinières (7/20) suggère qu’au moins une autre population d’interneurones ipsilatéraux participe, avec les V2b, au contrôle de la coordination fléchisseur-extenseur pendant la locomotion. De manière remarquable, lorsque à la fois les interneurones V1 et V2b sont inactivés, les demi-moelles épinières présentent toutes une synchronisation fléchisseur-extenseur, indiquant que les interneurones V1 et V2b participent ensemble au contrôle de la coordination fléchisseur-extenseur nécessaire à la locomotion (Zhang et al., 2014).
Ainsi, l’ensemble de ces résultats indique que les interneurones V2 sont une composante des CPG locomoteurs, dont les deux sous-populations V2a et V2b ont des rôles distincts, dans le contrôle de la coordination bilatérale et le rythme locomoteur, et dans le contrôle de la coordination fléchisseur-extenseur, respectivement.
3.5 Les interneurones V3
La population interneuronale V3, caractérisée par l’expression des facteurs de transcription Nkx2.2 et Sim1, est composée d’interneurones excitateurs localisés dans la lamina VIII (Briscoe et al., 1999). La plupart des interneurones V3 (85%) sont commissuraux et projettent directement sur les motoneurones controlatéraux (Zhang et al., 2008). Lorsque la transmission synaptique des interneurones V3 est génétiquement inactivée, la locomotion fictive néonatale est caractérisée par une activité irrégulière et asymétrique des racines ventrales gauche et droite d’un même segment spinal, avec une augmentation de la variabilité de l’amplitude et de la durée des bouffées d’activité. Le même phénotype a également été observé lors de la locomotion sur tapis roulant des souris adultes dont la transmission synaptique des interneurones V3 a été inactivée, suggérant un rôle de cette population neuronale dans la coordination des activités locomotrices générées de chaque côté de la moelle épinière (Zhang et al., 2008). Cependant, bien que les racines ventrales droite et gauche de de la moelle épinière produisent une activité ENG irrégulière, l’alternance gauche-droite n’est pas affectée par l’inactivation des interneurones V3, suggérant que cette population neuronale n’est pas responsable du contrôle de l’alternance bilatérale (Zhang et al., 2008). En revanche, les souris mutantes pour Nkx2.2 et Nkx2.9, ne possédant aucun interneurone V3, présentent des épisodes de synchronisation bilatérale pendant la locomotion sur tapis roulant (Holz et al., 2010). Ces dernières données restent difficile à interpréter car la mutation Nkx2.2-/- Nkx-/- altère la commissure ventrale, affectant ainsi
toutes les connections commissurales impliquées dans la coordination entre la gauche et la droite (Holz et al., 2010).
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3.6 Les interneurones Hb9
Les interneurones exprimant le facteur de transcription Hb9 (basic helix-loophelix domain containing, class B, 9) sont localisés dans la portion ventro-médiane de la moelle épinière, du segment cervical au segment lombaire (Hinckley et al., 2005, Wilson et al., 2005, Ziskind-Conhaim et al., 2010). Les interneurones Hb9 sont des neurones excitateurs glutamatergiques dont les projections axonales sont uniquement ipsilatérales (Hinckley et al., 2005). Ces interneurones sont rythmiquement actifs durant la locomotion fictive (Hinckley et al., 2005, Wilson et al., 2005) et ils possèdent des propriétés membranaires spécifiques des neurones oscillants, telles que les courant sodiques persistants (Ziskind-Conhaim and Hinckley, 2008) responsables des rebonds post-inhibiteurs (Wilson et al., 2005). Ainsi, même isolés synaptiquement par application de TTX, les neurones Hb9 conservent la faculté de produire des oscillations rythmiques de leur potentiel de membrane lors de l'application d’un cocktail de NMA/5HT utilisé pour induire la locomotion fictive (Wilson et al., 2005). Cependant, deux découvertes remettent en question le rôle central des neurones Hb9 dans l’initiation du rythme locomoteur (Kwan et al., 2009). D’une part, des études d’imagerie calcique ont montré que l’activité des neurones Hb9 débute le plus souvent après l’apparition des bouffées locomotrices enregistrées au niveau des racines ventrales. De plus, le nombre de neurones Hb9 par segment spinal (environ 40 chez la souris) serrait insuffisant pour la genèse d’une activité rythmique telle que la locomotion. Plus récemment, l’élimination génétique du transporteur vésiculaire du glutamate (vGluT2) dans les interneurones Hb9 a montré une plus grande variabilité dans le rythme locomoteur (Caldeira et al., 2017), suggérant que les interneurones Hb9 seraient donc importants pour stabiliser le rythme de marche.
Ainsi, l’ensemble de ces études, combinant électrophysiologie, traçage anatomique, ainsi qu’outils génétiques et moléculaires, a permis l’identification d’un grand nombre de populations d’interneurones spinaux, ainsi que la caractérisation de leurs rôles au sein du circuit locomoteur spinal des mammifères (Tableau 1). Cependant, l’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de ces populations neuronales spinales au cours du développement permet d’en découvrir encore d’avantage sur les composants de ces circuits.
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Tableau 1: Vision actuelle des populations interneuronales génétiquement identifiées et leur implication dans la locomotion. (Adapté de Gosgnach 2011).