Perte de la cystéine par oxydation en milieu complexe

Lors des premiers essais de quantification de la cystéine résiduelle par la réaction au DTNB, nous avons observé une diminution de la concentration en cystéine par rapport à la concentration initiale ajoutée dans les témoins PDB et BHI (milieux non inoculés mis en agitation). Dans ces témoins sans microorganisme, la cystéine peut avoir subi une réaction d’oxydation ou des réactions secondaires avec les composés du milieu, ces réactions pouvant aussi se produire pendant la congélation des échantillons.

la cystéine immédiatement après prélèvement à partir des milieux de culture PDB et BHI enrichis à 1,0 g/l en cystéine et placés sous agitation (90 et 150 rpm). Nous avons suivi aussi la perte de cystéine dans les milieux sans agitation afin d'établir la proportion de cystéine qui réagit directement avec les milieux. Finalement, la quantité de cystéine perdue après 48h de congélation à -20°C a été quantifiée.

L'objectif était de connaître précisément les pertes en cystéine après agitation et après congélation.

Nous observons (figure C-7) que la perte en cystéine est moins rapide et moins importante dans le milieu PDB que dans le milieu BHI dans les conditions d’agitation testées. Ainsi après 12h de suivi cinétique, 8% de la cystéine est perdu dans le milieu PDB sans agitation et à 150 rpm tandis que 17% est perdu dans le milieu BHI dans les mêmes conditions d'agitation. Par ailleurs, la perte en cystéine se poursuivit dans les deux milieux :à 48h de suivi cinétique, une perte maximale de 10% est quantifiée dans le milieu PDB avec et sans agitation. Dans le milieu BHI, la perte en cystéine est de 22% sans agitation et de 28% avec agitation. 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Temps (h) L -cystéi n e (m M ) 0 rpm 90 rpm 150 rpm 0 rpm 90 rpm 150 rpm BHI PDB

Figure C-7. Cinétique d’oxydation de L-cystéine dans les milieux PDB et BHI pour

différentes conditions d’agitation. La L-cystéine résiduelle a été quantifié par la ninhydrine acide. Moyenne de deux mesures indépendantes.

Nous supposons que cette perte serait due à l'oxydation du groupement thiol de la cystéine au-delà du disulfure (cystine), provoquée par l'oxygène dissous dans les deux milieux de culture liquides. En effet, les caractéristiques d'oxydoréduction de l'atome de soufre lui permettent d’avoir plusieurs niveaux d'oxydation. Ainsi, la cystéine peut s’oxyder en acide cystéine sulfinique (R-SO2H) et en acide cystéique (R-SO3H) par oxydation de la cystéine en

présence d’oxygène et de traces de métaux (tel que le fer ou le cuivre), ou d'autres composés oxydants. Ces réactions sont favorisées en conditions alcalines où le soufre est plus réactif (forme R-S-), ce qui pourrait expliquer la perte plus importante de cystéine dans le milieu BHI (pH 7,5) par rapport au milieu PDB (pH 5,1). Il faut des réducteurs plus forts que le DTT1 pour récupérer la cystéine à partir de ces produits d'oxydation. Malgré l’impossibilité de récupérer la cystéine à partir de ces composés, nous n'avons pas développé une nouvelle méthode de dosage de ces formes très oxydées de la cystéine. En effet, il est impossible de savoir, lors des cultures de micro-organismes, quelle part de cystéine sera effectivement transformée en des formes très oxydées car la quantité d’oxygène dissous dans le milieu est probablement très différente dans un milieu non ensemencé (utilisé pour quantifier ces pertes) et ensemencé. Il doit tendre vers zéro dans les conditions de croissance de micro-organismes aérobies (conditions d’agitation douces). Finalement, même si nous ne pouvons pas écarter la perte de cystéine par des réactions parasites (oxydation poussée ou autres réactions de type Strecker ou Maillard) étant donné la richesse en glucose du milieu PDB et la complexité du milieu BHI2, nous avons considéré lors des dosages de cystéine sur des milieux ensemencés, que, après réduction par le DTT, la différence entre les concentrations en cystéine initiale et finale correspondait à la fraction consommée par les micro-organismes.

Les échantillons du suivi cinétique ont été aliquotés, congelés et conservés à -20° C. Au bout de 48 heures, la cystéine résiduelle a été quantifiée après décongélation à température ambiante. Nous n'avons pas trouvé de différences significatives avant et après congélation, quel que soit le point de cinétique considéré, à l’exception du temps zéro (tableau C-1). Nous pensons que ces résultats indiquent une oxydation incomplète de la cystéine lorsqu'elle a été prélevée à t0. Cette oxydation a donc pu se poursuivre pendant les processus de congélation, de décongélation et d’analyse. Par ailleurs, après 48 h d'agitation, il ne semble plus avoir de

1 _{De test de réduction à l'aide de borohydrure de sodium (NaBH}

4) ont été réalisés pour récupérer la L-cystéine à

partir de ces composés, mais sans succès.

processus d'oxydation ; les échantillons prélevés après agitation seraient plus stables durant la congélation. En s’appuyant sur ces résultats, nous avons considéré que la congélation à -20°C avait une effet négligeable sur des échantillons contenant peu d'oxygène dissous, comme dans le cas de nos cultures microbiennes.

En résumé, nous avons constaté que la cystéine réagit dans les milieux de culture testés. La perte associée est plus marquée dans les milieux de culture complexes, comme le BHI, et sous agitation (oxydation poussée). Nous avons aussi montré que la congélation des échantillons à -20°C permettait de conserver convenablement la cystéine résiduelle.

Tableau C-1. Effet de la congélation pendant 48h à -20°C sur la L-cystéine résiduelle dans

les milieux PDB et BHI après agitation pendant 48h. Moyenne de deux déterminations indépendantes. Concentration en L-cystéine (mM) Milieu de culture Condition d'agitation Temps

d'agitation Avant congélation Après congélation

PDB 0 rpm 0h 8,2 ± 0,1 8,0 ± 0,1 48h 7,4 ± 0,1 7,3 ± 0,1 90 rpm 0h 8,3 ± 0,0 8,1 ± 0,1 48h 7,6 ± 0,1 7,5 ± 0,1 150 rpm 0h 8,2 ± 0,2 7,8 ± 0,0 48h 7,5 ± 0,2 7,1 ± 0,2 BHI 0 rpm 0h 8,4 ± 0,0 8,2 ± 0,0 48h 6,6 ± 0,1 6,5 ± 0,1 90 rpm 0h 8,5 ± 0,0 8,0 ± 0,2 48h 6,1 ± 0,1 6,1 ± 0,1 150 rpm 0h 8,3 ± 0,1 8,0 ± 0,1 48h 6,2 ± 0,1 6,0 ± 0,1

IX. CRIBLAGE DES SOUCHES ET PRODUCTION DE