A NALYSES CHIMIQUES

VII.2.1. Dosage de la L-cystéine

Nous avons utilisé deux méthodes pour le dosage de la L-cystéine. Premièrement, nous avons essayé la méthode de Russell et col. (1997) basée sur la dérivation du groupe thiol de la cystéine par le DTNB suivie de leur séparation par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Dans un deuxième temps, la réaction à la ninhydrine acide suivie d'une quantification au spectrophotomètre a été utilisée (Gaitonde, 1967).

VII.2.1.1. Méthode par dérivation au DTNB

5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoïque) réagit avec le groupe thiol de la cystéine en libérant l’acide 5-thio-2-nitrobenzoïque (TNB). Les produits de cette réaction sont ensuite séparés par CLHP et quantifiés grâce à leur absorbance à différentes longueurs d'ondes : le DTNB résiduel absorbe à 325 nm, la cystéine dérivée à 357 nm et le TNB à 412 nm.

Réaction générale + + CH3 N+ O- O S H i o n C H3 N+ O- O S O NH2 S OH Cystéine Derivée C H3 N+ O- O S CH3 N+ O- O S D T N B O NH2 SH OH L- Cystéine Cas de la L-Cystéine i o n Thiol Derivé

acide 5-thio- 2-nitrobenzoique acide 5,5’ dithio-bis (2-nitrobenzoique)

D T N B Thiol Libre C H3 N+ O- O S CH3 N+ O- O S ₊ CH3 N+ O- O S H + SH R C H3 N+ O- O S S R 412 nm λ de détection : 325 nm 210 nm 357 nm

Figure B-2. Principe de la dérivation avec le réactif d'Ellman (DTNB).

Sachant que la L-cystéine s'oxyde très rapidement en solution en L-cystine, nous avons effectué tout d’abord la réaction inverse (réduction de la L-cystine) à l’aide du dithiotritol (DTT). L'objectif était d'assurer le dosage de la L-cystéine totale (L-cystéine+L- cystine) . 250 µl d’échantillon de culture préalablement décongelé et filtré (fibres de verre, 0,2 µm, Whatman) ont été réduits par 250 µl de DTT 8 mM pendant 30 minutes à température ambiante. La cystéine résiduelle totale a été ensuite dérivée avec 1500 µl de DTNB 8 mM pendant 20 minutes. Le DTT et le DTNB sont préparés dans du tampon phosphate PBS2

La cystéine dérivée est ensuite analysée par CLHP. 75 µl du mélange de dérivation est donc injecté automatiquement (injecteur SIL-9A, Shimadzu). La séparation est réalisée sur phase inverse (colonne Waters Symmetry C18, tailles de particules 3,5 µm, tailles de pores 100 °A, longueur 100 mm, diamètre 4,6 mm).

La phase mobile, conservée à température ambiante, est constituée d'un mélange de PBS et de méthanol. Deux pompes (Waters, modèle 510) permettent de contrôler le débit des deux solvants, tandis qu'un contrôleur de gradient automatique (Waters 600) réalise le gradient de solvants. Le gradient appliqué est le suivant : 100% PBS pendant 20 minutes à 0,25 ml/min, passage à un gradient de PBS/méthanol pendant 40 minutes à 1,0 ml/ min jusqu'à 82,5% de PBS et 17,5% de méthanol, et enfin 100% de PBS pendant 5 minutes à 1,0 ml/min.

La détection est réalisée grâce à un spectrophotomètre à balayage de diodes (Photodiode 996, Waters) dont les longueurs d’ondes ont été ajustées à 325, 357 et 412 nm.

VII.2.1.2. Réaction à la ninhydrine acide

Les acides aminés peuvent réagir avec la ninhydrine dans des conditions de pH ≥ 5 pour donner un composé de couleur pourpre caractéristique, ayant une absorbance maximale à 570 nm (figure B-3). Pourtant, dans de telles conditions de pH, la L-cystéine ne réagit pas et la L-cystine ne réagit pas complètement (50% de la réaction totale).

La réaction de la ninhydrine avec la L-cystéine devient spécifique et plus sensible à un pH compris entre 0,0 et 1,0, en abaissant le pH avec de l’acide chlorhydrique concentré (Gaitonde, 1967). Dans ces conditions, la L-cystéine réagit et donne un produit de couleur rose caractéristique qui présente un maximum d’absorbance à 560 nm. Par ailleurs, à ce pH, les autres acides aminés ne réagissent pas. La relation absorbance/concentration en L-cystéine est linéaire pour des concentrations en L-cystéine inférieures ou égales à 1,0 mM.

Un volume de 500 µl de DTT 10mM et 20 µl de NaOH 1N sont ajoutés à 500 µl d’échantillon, précédemment dilué à un dixième avec de l’eau désionisée. L'ensemble est laissé pendant 30 minutes à l’obscurité3_{. La ninhydrine est préparée extemporanément en}

diluant 250 mg de ninhydrine dans 10 ml d’une solution formée par 6 ml d’acide acétique concentré (99.5%) et 4 ml d’acide chlorhydrique concentré (36%). Le mélange est ensuite agité de 20 à 30 minutes jusqu'à complète dissolution de la ninhydrine. 0,5 ml d’échantillon réduit, 0,5 ml d’acide acétique concentré et 0,5 ml de réactif de ninhydrine sont alors mélangés dans des tubes en verre à vis. Après agitation, les tubes sont placés dans un bain d’eau bouillante pendant 10 min. Ils sont ensuite refroidis rapidement à l’eau froide et 3,5 ml d’éthanol sont alors ajoutés.

L'absorbance du mélange est mesurée à 560 nm (spectromètre UV-2100, Shimadzu) dans les 30 minutes suivantes. Un blanc est systématiquement réalisé en suivant la même procédure mais en utilisant 0,5 ml d’eau4.

O O OH OH

+

+

Figure B-3. Réaction générale des acides aminés avec la ninhydrine. Le produit de couleur

pourpre est détecté à 570 nm (Belitz et Grosch, 1999).

VII.2.2. Dosage de l’H2S par synthèse du bleu de méthylène

Le dosage de l’H2S est basé sur la réaction de synthèse du bleu de méthylène (Fogo et

Popowski, 1949). L'H2S réagit avec deux molécules d'aniline (N,N-diméthylbenzene-1,4-

4 _{Il faut prendre plusieurs précautions. Tout d'abord, éviter tout contact du réactif de ninhydrine avec la peau ;}

les 10 min de chauffage sont à respecter très précisément : si le mélange réactionnel est chauffé moins de temps la couleur caractéristique de la cystéine ne se développe pas complètement, par contre, s'il est surchauffé une forte coloration violacée est observée et la concentration en cystéine peut alors être surestimée. Une autre

diamine) et forment un intermédiaire incolore, le blanc de méthylène. Celui-ci est alors oxydé par le Fe3+ en formant le bleu de méthylène (figure A-13).

Nous avons suivi la même procédure pour le dosage de l'H2S dans toutes les cultures,

sauf en ce qui concerne la concentration d'aniline. En effet, une concentration de 0,5 g/L d'aniline est utilisée pour les cultures réalisées sans cystéine (faible production d’H2S) et de

8,0 g/L d'aniline pour les cultures sur cystéine. Les solutions d'aniline (0,5 g/l ou 8,0 g/l) sont préparées dans de l'HCl 5,5 M. Le chlorure de fer (FeCl3) 0.023 M est préparé dans de l'HCl

1,2 M.

Après récupération du milieu de culture, 2 ml de réactif d’aniline sont ajoutés dans les flacons piège sur la couche d’agar. Après 10 minutes, 400 µl de chlorure de fer sont ajoutés et laissés pendant 20 minutes. Puis, le mélange est transvasé dans une cuvette spectrophotométrique et l'absorbance est déterminée à 670 nm. Dans le cas de solutions troubles, le mélange est préalablement centrifugé pendant 10 minutes à 10 000 rpm et 25°C. Les absorbances obtenues sont reportées sur une gamme étalon de sulfide de sodium (Na2S)

faite au préalable pour calculer les concentrations en H2S de chaque culture.