Pour la conception de ces ch´elateurs, nous nous sommes inspir´es des mol´ecules du vivant `a savoir les m´etallochaperonnes et les m´etallothion´eines qui ont, dans leur site de fixation du m´etal, des cyst´eines.
Figure 40 – `a gauche : Structure de Atx1 (eqv. Atox1 dans la levure [38]), `a droite : Struc-
ture chimique des m´ethallothion´eines cluster Cu7-MT (Saccharomyces cerevisiae) [203]
Le cuivre(I) au sein des m´etallochaperonnes est bicoordin´e par les cyst´eines du site de fixation, et au sein des m´etallothion´eines, il est tricoordin´e. L’´elaboration de syst`emes comportant deux ou trois cyst´eines semble donc coh´erente avec les sites de liaison identifi´es dans le vivant.
Le premier organe touch´e, dans la maladie de Wilson, est le foie. Le cuivre(I) s’y accumule et pourtant aucun traitement actuel ne le cible. Voil`a pourquoi nous proposons l’´elaboration de syst`emes capables de cibler cet organe. Cela permettrait de d´etoxifier le cuivre(I) dans les cellules h´epatiques et donc d’aider les malades qui ont le foie tr`es atteint (h´epatique aig¨ue ou fulgurante). Le choix des r´ecepteurs aux asialoglycoprot´eines, comme cible, semble judicieux puisqu’ils sont situ´es `a la surface des cellules h´epatiques.
Les syst`emes envisag´es seront donc compos´es de deux parties (Fig 41), `a savoir, une partie ch´elatante pour r´ecup´erer le m´etal, et une partie ciblante pour entrer dans les cellules h´epatiques.
Figure 41 – Sch´ematisation du syst`eme
Dans le chapitre suivant du manuscrit, nous pr´esenterons l’´elaboration de syst`emes d´eriv´es du peptide mod`ele d’Atx1, PC, comportant deux cyst´eines. Les syst`emes que nous
sur la complexation de ces peptides vis-`a-vis du cuivre(I) et des autres m´etaux d10pr´esent´es
Cyclod´ecapeptides
`a
deux
cyst´eines comme complexants du
cuivre(I)
C C
Troisi`eme partie
Cyclod´ecapeptides `a deux cyst´eines
comme complexants du cuivre(I)
5
Pr´eambule : Strat´egie de conception
Un cyclod´ecapeptide, PC, mimant la boucle de liaison du cuivre connue dans les
m´etallochaperonnes, a ´et´e ´etudi´e au laboratoire [202] [201]. Ce compos´e poss`ede une boucle de liaison flexible contenant deux cyst´eines dans la s´equence MXCXXC, et un coude β de type II (XPGX) pour rigidifier le syst`eme. La comparaison de PC avec son analogue lin´eaire
PL montre que l’insertion d’un coude β de type II entraine une certaine stabilisation des
complexes form´es. La formation de complexes monom´etalliques lin´eaires avec le cuivre(I) et le mercure(II) et de complexes de type 1 :1 et 1 :2 (M :L) pour les m´etaux zinc(II), plomb(II) et cadmium(II) a ´et´e observ´ee [202]. Ce cyclod´ecapeptide, a montr´e de bons r´esultats vis `a vis de la complexation du cuivre(I). La constante d’affinit´e de PC pour ce
cation m´etallique est proche de celle connue pour les m´etallochaperonnes. Il pr´esente aussi une forte s´electivit´e par rapport au zinc, de dix ordres de grandeur [202]. Cela montre qu’une s´equence d’acides amin´es, comportant deux cyst´eines, pr´esente une forte s´electivit´e Cu(I)/Zn(II) et une forte affinit´e pour Cu(I).
Ces r´esultats int´eressants, nous ont conduits `a envisager l’utilisation de peptides `a deux cyst´eines comme ch´elateurs potentiels pour les maladies de type Wilson.
Comme ´evoqu´e pr´ec´edemment, nous souhaitons ´elaborer un syst`eme comportant une partie ch´elatante et une partie ciblante. Pour ceci, une plate-forme comportant deux faces, l’une pour la ch´elation, l’autre pour le ciblage, semble judicieuse. Nous avons donc choisi d’utili- ser un squelette peptidique, d´evelopp´e il y a quelques ann´ees par l’´equipe de Mutter [204]. Cette structure peptidique est d´eriv´ee du mod`ele peptidique TASP (Template-Assembled Synthetic Peptide) [205] d´evelopp´e afin de mimer les propri´et´es structurales et fonction- nelles des prot´eines naturelles [206] [207]. Par exemple, quatre h´elices α ont ´et´e greff´ees sur
la plate-forme peptidique TASP pour mod´eliser les propri´et´es structurales de complexe majeur d’histocompatibilit´e de classe I. Cette plate-forme favorise alors les interactions possibles entre les quatre h´elices.
Figure 42 – Sch´ematisation de la mol´ecule TASP comportant quatre h´elices α [207]
La structure RAFT (Regioselectively Addressable Functionalized Template), d´eriv´ee du TASP, est une plate-forme rigide pr´esentant deux faces ind´ependantes qui sont chi- miquement modifiables pour greffer d’autres structures d’int´erˆet [208]. Grˆace `a ce sque- lette peptidique, il est possible d’obtenir un syst`eme comportant sur une face des ligands r´egios´electifs d’un syst`eme biologique (ciblage) [209] [210] et sur l’autre face des unit´es fonctionnelles telles que des mol´ecules d’int´erˆet biologique (compos´es cytotoxiques pour la th´erapie canc´ereuse [211] [212], vaccins [208]. . .) ou des ≪mol´ecules sondes≫ pour l’ima-
gerie [211] [213] (Fig 43). G10 K1 X2 K3 P4 P9 K8 K7 K6 G5 Structure peptidique Partie ciblante Partie active:
Molécules d'intérêt biologique
L’analyse structurale de cyclod´ecapeptides RAFT par des techniques de RMN en so- lution et par diffraction des rayons X ont permis de mettre en ´evidence la rigidit´e de ces syst`emes [214] [215]. En effet, l’insertion de la s´equence d’acides amin´es XGPX permet la formation de deux coudes β de type II. La rigidit´e de ces deux coudes est accentu´ee par la formation de liaisons hydrog`enes intramol´eculaires entre les acides amin´es en position 3-6 et 1-8 (Fig 43). Tout ceci permet d’orienter les chaˆınes lat´erales des acides amin´es, en position 2 et 7, dans la mˆeme direction de l’espace et celles en position 1, 3, 6 et 8 dans la direction oppos´ee (Fig 43) [214].
En consid´erant cet arrangement, la position des cyst´eines du cyclod´ecapeptide PC a donc
´et´e modifi´ee pour pr´ef´erer les positions 2 et 7 pour pouvoir utiliser les positions 1, 3, 6 et 8 pour le ciblage cellulaire. Deux cyclod´ecapeptides ne comportant que la partie com- plexante (c’est `a dire sans le syst`eme de ciblage), avec deux cyst´eines en position 2 et 7, ont ´et´e synth´etis´es afin de tester leur affinit´e et leur capacit´e de ch´elation vis `a vis du cuivre(I) et des autres m´etaux d10. En effet, le mod`ele RAFT est plus structur´e et rigide
que le mod`ele de chaperonne PC pr´ec´edemment ´elabor´e : la pr´esence des deux coudes β de
type II contraint la conformation du squelette peptidique en feuillets β antiparall`eles [214]. Cette rigidit´e peut ˆetre favorable ou d´efavorable `a la complexation. L’orientation des deux
cyst´eines va-t-elle favoriser, comme pour PC, des complexes 1:1 pour le cuivre(I) et le
mercure(II) et des complexes 1:1 et 1:2 pour les trois autres m´etaux ? Un tryptophane a ´et´e introduit dans la s´equence peptidique, afin de pouvoir contrˆoler la concentration du
peptide en solution, par absorption UV-visible `a 280 nm (ǫ = 5690 M−1 cm−1). Except´ee
la pr´esence de deux cyst´eines en positions 2 et 7, des deux coudes β, et du tryptophane, les deux cyclod´ecapeptides sont diff´erents. En effet, le peptide P1 poss`ede une face sup´erieure polaire (deux s´erines et une arginine charg´ee > 0) tandis que P2 est fortement charg´e
n´egativement (une aspartate et deux glutamates) apportant trois carboxylates (COO−) `a
pH physiologique. La comparaison entre ces deux peptides permet d’´evaluer l’influence des chaˆınes lat´erales sur la complexation (Fig 44).
Gly Pro Ser Cys Gly Pro Trp Cys Ser Arg P1 SH SH Gly Pro Glu Cys Gly
Pro Asp Cys Glu Trp P2 SH SH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6
Synth`ese et caract´erisation
6.1
Synth`ese peptidique
La synth`ese peptidique sur support solide a ´et´e introduite en 1963 par R.B. Merri- field [216]. Elle met en jeu un support constitu´e de petites billes d’un polym`ere (appel´e r´esine) insoluble, inerte dans les conditions de la synth`ese. En revanche, ces polym`eres ont la particularit´e de gonfler dans les solvants utilis´es, ce qui assure une bonne diffusion des r´eactifs. Le premier acide amin´e est fix´e sur la r´esine par une liaison covalente. Le second acide amin´e est alors ajout´e en solution, souvent en large exc`es. Le produit de la r´eaction reste li´e `a la r´esine insoluble et est ainsi facilement s´epar´e des exc`es de r´eactifs et des solvants par simple filtration et ainsi de suite. La liaison qui relie le peptide form´e `a la r´esine est alors rompue et le produit de la r´eaction r´ecup´er´e dans le filtrat. La simplicit´e de cette m´ethode, qui facilite son automatisation, en a fait un outil pr´ecieux en chimie combinatoire classique comme en synth`ese parall`ele.
La synth`ese, des cyclod´ecapeptides P1 et P2, a ´et´e r´ealis´ee dans des conditions clas-
siques de synth`ese peptidique en phase solide (SPPS) en utilisant la strat´egie ≪Fmoc≫,
c’est `a dire que tous les acides amin´es sont prot´eg´es en leur extr´emit´e N -terminale par le
groupement protecteur 9-fluor´enylm´ethyloxycarbonyle (Fmoc). La strat´egie ≪Fmoc≫est
la plus utilis´ee en SPPS depuis 25 ans [217]. Les raisons sont : la stabilit´e du groupement
≪Fmoc ≫ en pr´esence d’acide trifluoroac´etique (TFA) et sa d´eprotection en pr´esence de
pip´eridine 20% dans la dim´ethylformamide (DMF) qui permet un suivit UV-visible de la synth`ese peptidique (dosage de l’adduit dibenzofulvene-piperidine `a 299 nm) [218].
Le couplage peptidique est effectu´e en pr´esence de benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino- phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), qui active la fonction acide carboxylique des acides amin´es et facilite ainsi le couplage peptidique. Apr`es chaque couplage d’un nouvel acide amin´e, une ´etape d’ac´etylation est r´ealis´ee pour bloquer les fonctions amines qui n’auraient pas r´eagi. Cela permet d’arrˆeter toute chaˆıne peptidique parasite en croissance parall`ele `a celle souhait´ee. La r´esine utilis´ee, lors de la synth`ese, est la 2-chloro chloro- trityle [219]. Cette r´esine permet d’obtenir le peptide sous forme acide en son extr´emit´e C -terminale [220] et permet de d´ecrocher le peptide greff´e dans des conditions douces `a savoir TFA/DCM (v/v = 99/1) [221]. Ces conditions ´evitent la d´eprotection des chaˆınes lat´erales. Apr`es avoir d´ecroch´e le peptide, la cyclisation du peptide lin´eaire est r´ealis´ee, dans le dichlorom´ethane, en milieu homog`ene, `a concentration dilu´ee, afin d’´eviter la formation d’oligom`eres. Les chaˆınes lat´erales sont ensuite d´eprot´eg´ees [222] et le cyclod´ecapeptide obtenu est purifi´e par HPLC pr´eparative sur colonne RP-18. Les produits P1 et P2 ont ´et´e
W(Boc)C(Trt)E(tBu)PGE(tBu)C(Trt)D(tBu)PG W1 C2 G10 P9 E3 P4 D8 C7 E6 G5 P2 R(Pbf)C(Trt)S(tBu)PGS(tBu)C(Trt)W(Boc)PG R1 C2 G10 P9 S3 P4 W8 C7 S6 G5 P1 H
W(Boc)C(Trt)E(tBu)PGE(tBu)C(Trt)D(tBu)PG
H OH W C G P E P D C E G tBu Trt Boc tBu Trt tBu R(Pbf)C(Trt)S(tBu)PGS(tBu)C(Trt)W(Boc)PG OH H H R C G P S P W C S G tBu tBu Trt Trt Pbf Boc Clivage Cyclisation Déprotection Clivage Cyclisation Déprotection Figure 45 – Synth`ese de P1 et P2