Le projet que je souhaite développer s’oriente sur la mise en place de méthodologies innovantes en spectrométrie de masse, notamment de très haute résolution, permettant de guider les avancées dans le cadre du développement durable et de l’environnement. Il s’agit de mettre à contribution de nouveaux développements pour permettre de nouveaux modes de production, de consommation et de cadre de vie. En particulier, les domaines de l’énergie, de l’environnement, et du vivant ont besoin de ces diagnostics à l’échelle moléculaire pour comprendre et agir sur leur préservation et accessibilité.
Mon projet s’inscrit en partie dans les perspectives de mes recherches actuelles et implique également une orientation plus spécifique vers de nouvelles approches, notamment dans le cadre de l’imagerie par spectrométrie de masse. Il s’appuie sur des collaborations, avec des collègues du groupe de spectrométrie de masse du laboratoire et/ou des collègues chercheurs de différentes disciplines mais également sur des développements qui me sont propres.
Energie
La conversion de la biomasse non alimentaire (et renouvelable) en produit valorisable est une voie séduisante pour produire des molécules de base pour la synthèse ou des bio-carburants capables de remplacer nos productions à base de pétrole. Pour garantir ces développements, nous avons pu proposer la caractérisation et le suivi des produits lourds par une approche pétroléomique la plus étendue possible. L’information moléculaire est exhaustive puisque plusieurs milliers de composés sont révélés par leurs formules élémentaires.
Cependant, il peut être avantageux d’intégrer à ces informations des données sur les groupements fonctionnels que certaines de ces molécules présentent afin de mieux comprendre la réactivité de ces mélanges et agir et préserver de manière ciblée ces composés lors du processus de transformation. L’idée que je souhaite suivre dans ce projet est d’associer à l’approche pétroléomique une ou plusieurs étapes permettant d’accéder à l’identification de fonctions chimiques d’un composé, en plus de sa formule brute. C’est une dimension supplémentaire et unique qui pourrait être apportée aux capacités d’analyse actuelles. Les études par spectroscopie RMN ou IR de ces mélanges sont particulièrement intéressantes lorsqu’elles sont également conduites en parallèles à des analyses par MS à haute résolution. Cependant, elles se limitent à une description des fonctions chimiques globales de l’échantillon.
Une première preuve de ce concept a pu être obtenue pour identifier les composés présentant une fonction carbonyle. Dans ce cadre nous avons montré que l’ajout d’une amine primaire à une solution de bio-huile permet lors du passage dans la source ESI (chauffée) de former spécifiquement des bases de Schiff (imines secondaires) avec les composés carbonylés (représentant potentiellement 25 % des composés d’une bio-huile) comme indiqué par l’équation suivante :
R1 NH2 R2 R3 O R2 R3 N R1 H2O + + ESI
En choisissant un groupement R1 ayant une signature spécifique en MS (ex : C6H4Cl), il est alors possible d’identifier les composés d’un mélange, initialement analysés par ESI-MS sans réactif, apparaissant avec une masse décalée de m(N-R1)-m(O) et reconnaissables par une distribution isotopique spécifique, celle du chlore56.
Outre l’utilisation systématique de cette approche, les actions qui seront menées dans cette partie du projet porteront sur la mise en place de méthodes similaires impliquant des réactions spécifiques de groupements fonctionnels susceptibles d’être présents d’un point de vue général dans les mélanges complexes quels qu’ils soient. L’action de ces « révélateurs » peut également être élargie si on considère les phénomènes stériques associés. La modification des structures des réactifs utilisés pourrait également être exploitée pour appréhender les positions des groupements dans les structures moléculaires étudiées.
Le deuxième aspect que je souhaite aborder dans ce domaine concerne la recherche d’informations structurales sur les composés analysés par une approche pétroléomique. Chaque pic d’un spectre de masse attribué à une combinaison d’atomes ne fournit pas d’information sur la structure d’un composé. La méthode MS de choix pour obtenir ce type d’information est la spectrométrie de masse en tandem. Dans ce cas, les ions à une valeur m/z sont isolés puis subissent des fragmentations pour en obtenir des ions fils. Les ions fragments se forment de manière dépendante de la structure des ions parents et renseignent ainsi sur l’agencement structurel des molécules de l’échantillon analysé. Cependant, la complexité des spectres obtenus en pétroléomique, où plusieurs dizaines de contributions peuvent être détectés à chaque masse nominale, ne permet pas une isolation efficace d’un ion à une valeur m/z précise. En considérant les capacités de la cellule d’analyse ICR du spectromètre de masse à positionner des groupes d’ions dans des zones spatiales bien spécifiques, l’approche permettant l’obtention de données structurales peut être différente. En effet, le groupe de Peter O’Connor (Department of Chemistry, University of Warwick, Coventry, UK) et celui de Christian Rolando (Miniaturisation pour la Synthese, l'Analyse et la Proteomique, Université de Lille) développent la 2D FT-ICR MS.57 Cette méthode engageant des impulsions d’excitation déphasées et une technique de fragmentation localisée permet d’obtenir en quelques heures des cartes à dimension MS et dimension MS/MS sur des mélanges de peptides et plus récemment sur des polymères. Dans le cadre de ce projet, cette méthode d’analyse appliquée à des mélanges tels que les bio-huiles, ajoutera une dimension d’analyse structurale jusqu’alors jamais proposée. J’ai pu réaliser des premiers tests sur une bio-huile analysée par ESI 2D-FT-ICR MS à Warwick qui ont montré la faisabilité de l’expérience. Une collaboration avec ces groupes pour implémenter cette méthode au laboratoire est en passe d’être mise en place.
Toujours dans un effort d’apporter une description moléculaire la plus exhaustive possible des mélanges complexes comme les bio-huiles, il peut être particulièrement intéressant de travailler avec au moins une dimension supplémentaire de séparation. C’est une remarque très générale mais différentes approches seraient intéressantes à mettre en place au laboratoire. Dans le but de limiter la compétition à l’ionisation et exploiter la gamme dynamique de fonctionnement d’un spectromètre de masse, différents types de séparations peuvent être envisagées. La séparation pré-analyse en fractions en fonction de l’acidité ou de la polarité a montré une augmentation nette du nombre de compositions élémentaires attribuées lors de l’analyse FT-ICR MS de pétroles bruts (jusqu’à un facteur 10).58 L’utilisation de système chromatographique en amont du spectromètre se développe pour l’étude de bio-huiles , telle que la chromatographie en phase supercritique (SFC) qui montre de meilleures capacités de séparation que la chromatographie liquide mais semble limitée à des composés de plutôt faibles masses (<400 Da).59,60 L’intérêt de ces systèmes est également leurs capacités à séparer des isomères, ce que l’analyse par introduction directe en FT-ICR MS ne permet pas.
Une alternative à l’emploi des méthodes séparatives traditionnelles existe. Il s’agit de la mobilité ionique qui est en plein développement ces dernières années. Sans régler le problème de la compétition à l’ionisation, elle permet de séparer des isomères et de séparer des ions homologues issus d’un mélange complexe.61
Couplée à la FT-ICR MS, ce système en mode TIMS, apporte indéniablement un intérêt pour de nombreuses applications62, y compris pour l’analyse par ionisation MALDI. Un projet d’implantation de cette technologie est actuellement à l’étude au laboratoire. L’accès à la mobilité ion au laboratoire devrait par ailleurs être permis dans le cadre du prochain CPER au travers de l’acquisition d’un dispositif de type TIMS-ToF.
Enfin, dans le cadre de l’ERC « ReaLyse » déposé cette année par Anthony Dufour, nous avons comme projet la mise en place d’un système d’analyse permettant l’étude d’oligomères générés lors de la pyrolyse du bois. Plus concrètement, sur un microréacteur à pyrolyse laser, nous prévoyons de développer une interface permettant l’analyse en ligne par FT-ICR MS des produits de pyrolyse. La détermination des espèces intermédiaires générées dans des conditions de pyrolyse contrôlées de différentes biomasses permettra le développement d’un nouveau modèle cinétique à l’échelle moléculaire.
Environnement
Le principal sujet traité dans ce projet sera un mélange complexe préoccupant pour la santé, les particules atmosphériques. Les développements MS proposés dans ce projet associés à la problématique énergie présentent également un fort intérêt pour la recherche de données structurales et chimiques sur les composés constituant pour partie les particules atmosphériques. Outre ces aspects, qui nécessitent d’être conduits par une source d’ionisation continue par infusion d’un extrait, l’intérêt d’une source d’ionisation permettant une détection sensible de composés directement sur leurs supports de prélèvement est particulièrement élevé. Nous avons pu l’observer par LDI de différents types de particules, notamment celles issues des fumées de cigarette. Cependant, l’analyse LDI de particules nécessitait de se placer sous un vide poussé (de l’ordre de 10-7 mbar).
L’approche qui sera développée dans cette partie du projet correspond à la mise en place de l’analyse de particules positionnées sur leur support de collecte dans des conditions de pression atmosphérique. L’intérêt sera double : un gain de temps d’analyse des échantillons et la limitation de la perte des composés volatils. Pour permettre ces études, deux sources d’ionisation à pression atmosphériques sont « couplables » au spectromètre de masse de très haute résolution. Il s’agit de la source DART (Direct Analysis in Real Time – source de composés métastables)63 et de l’APLI (Atmospheric Pressure Laser Ionisation)64. La première source vient d’être livrée avec le nouvel instrument dans le cadre du programme RESEX et la seconde nécessitera un développement méthodologique et instrument que je mettrai en place dans les prochaines années avec les autres acteurs du laboratoire. Aucune source d’ionisation n’est évidemment universelle et l’objectif sera aussi de cerner l’apport de chacune de ces sources sur l’étude de la composition de particules atmosphériques (fumées de cigarette comme modèle – autres particules issues de collaborations). Actuellement, seule l’analyse de la nicotine, d’extraits de tabac ou de particules issues de sa fumée ont été conduites par DART-MS(/MS).65–67
Un point non sans importance n’a pu être traité lors des analyses de particules atmosphériques par LDI FT-ICR MS et qui pourra également être exploré avec d’autres sources d’ionisation à pression atmosphérique. Il concerne l’étude de la dépendance de leur composition chimique en fonction de leur granulométrie. C’est une information capitale pour comprendre les risques auxquels une personne est exposée en présence de ces particules (air en milieu professionnel par exemple) ou pour envisager leur dynamique de transport. En effet, la profondeur de pénétration des particules dans le tractus respiratoire conditionne leurs effets sur la santé. Dans ce cadre, il sera nécessaire de s’équiper d’un impacteur à cascade capable de récupérer des particules de différentes granulométries (système de collecte sur des filtres – de quelques µm à quelques nm).
Par ailleurs, dans le cadre de la pollution des eaux, l’analyse non-ciblée par spectrométrie de masse de haute résolution a toute son importance. Le système d’étude est particulièrement complexe et une grande variété de composés organiques y évolue. Dans le cadre de pollutions sévères de cours d’eau, nous avons à plusieurs reprises été sollicités par nos collègues pompiers du SDIS 57 avec qui nous travaillons en support pour l’identification de composés chimiques sur les terrains d’intervention. D’autre part, un projet de recherche est initié avec l’ANSES concernant la problématique des composés perfluorés dans l’eau. Nous avons alors dans ces différentes actions pu observer que l’approche non-ciblée permettait de mettre en lumière beaucoup plus de composés que ceux suivis « classiquement » par des méthodes d’analyses ciblées. Cependant, la grande quantité d’informations recueillies lors de l’analyse de tels échantillons rend complexe l’appréhension des disparités de composition entre échantillons. Je souhaite dans cette approche mettre en place des traitements statistiques des données (PCA, PLS). Ces méthodes sont maintenant souvent employées pour l’étude de grandes quantités de données de ce type mais, n’étant que peu employées au sein du laboratoire, elles apporteraient un gain non-négligeable de temps de traitement pour apporter des réponses à nos partenaires.
Domaine du vivant
Le domaine du vivant est fascinant et extrêmement complexe. A l’échelle d’observation moléculaire, il est indéniable que la spectrométrie de masse est incontournable. Nous l’avons vu pour les feuilles de vignes infectées par un pathogène, pour lesquelles certains métabolites ont pu être observés.
La spectrométrie de masse dans ce domaine prend une dimension supplémentaire lorsque les analyses sont conduites en mode imagerie. Il devient alors possible de localiser plusieurs composés à la surface d’un échantillon. Le potentiel de cette approche est unique.
Dans cette dernière partie de mon projet, je souhaite pousser les limites de l’imagerie par spectrométrie de masse pour rechercher des composés endogènes ou exogènes à un organisme, ainsi que ceux associés spécifiquement aux interactions entre organismes.
Dans ce cadre, il est envisagé de reprendre les études systématiques de localisation de certaines phytoalexines sur différentes variétés de vigne (Collaboration Unité Recherche EA 4707 RIBP - Résistance Induite et Bioprotection des Plantes, Université de Reims Champagne Ardennes). Les recherches seront étendues et appliquées aux formes hautement polymérisées de phytoalexines stilbéniques plus fongitoxiques, y compris les trimères et tétramères.68 Leurs identifications et leurs localisations suivant le stade d’évolution de l’interaction entre la vigne et différents agents pathogènes (Plasmopara viticola, Botrytis cinerea, etc.) permettra une meilleure compréhension des mécanismes d’interaction et d’envisager d’éliciter leur production par la vigne et par d’autres plantes.69 Il s’agira particulièrement de rechercher et localiser des formes plus complexes (polymériques) de ces polyphénols lorsque la plante est soumise à différentes conditions de stress (infection, présence d’éliciteurs, sol enrichi ou appauvri en certains nutriments).
Plusieurs projets commencent également à émerger et la demande de nos collègues biologistes est particulièrement soutenue. Il s’agit d’apporter des informations moléculaires sur la localisation de composés susceptibles d’être impliqués :
- dans la maladie du bois (Collaboration Institut Universitaire de la Vigne et du Vin (IUVV) - Université de Bourgogne Franche-Comté, Unité Recherche EA 4707 RIBP - Résistance Induite et Bioprotection des Plantes, Université de Reims Champagne Ardennes),
- lors de l’interaction entre microorganismes telles que des bactéries et champignons (balance bénéfices/risques) (Collaboration UL-INRA Dynamic, IAM),
- lors de l’accumulation et la transformation de composés exogènes dans des végétaux ou organismes aquatiques (collaboration LIEC, CNRS-UL) – lien avec action environnement.
- dans la stabilité colloïdale du vin en fonction de nouveaux procédés œnologiques (collaboration avec l’Unité de recherche Œnologie EA 4577, et les sociétés Biolaffort et Bucher Vaslin)
Finalement, pour chacun de ces projets d’imagerie, la préparation d’échantillon avant l’analyse par MALDI-MS doit être entièrement reconsidérée, y compris le choix et le mode de dépôt d’une matrice MALDI qui constitue le point critique de cette approche. Dans le cadre de ces études, j’intègrerai systématiquement la réalisation d’images par MALDI FT-ICR MS ce qui est un point particulièrement important pour augmenter la fiabilité de leur interprétation. Finalement, l’imagerie MALDI MS représente une multitude d’analyses non-ciblées réalisées sur différentes parties d’un organisme. Les outils statistiques sont par conséquent particulièrement adaptés pour rechercher les informations d’intérêt lors du traitement et de la comparaison d’images moléculaires. Nous venons de nous équiper d’un logiciel capable de mener ces traitements sur grand nombre de données dans le cadre du réseau TGE FT-ICR (capable de gérer plusieurs dizaines de Go par image obtenues par MALDI FT-ICR MS – Logiciel SCiLS lab commercialisé par Bruker).
D’autre part, pour répondre à la recherche spécifique de certains composés, je souhaite mener des études plus fondamentales sur la FT-ICR MS. L’ajout d’une ligne photonique supplémentaire adaptée à d’autres longueurs d’onde permettra d’évaluer la sélectivité de l’ionisation laser en fonction de la longueur d’onde. Nous avions en effet démontré l’efficacité de l’ionisation à 266 nm pour détecter spécifiquement certains métabolites aromatiques par LDI (processus d’ionisation biphotonique).46 De plus, la source d’ionisation laser actuelle du spectromètre de masse fonctionne à une pression assez élevée (1 Torr). L’influence de ces conditions sur la génération des ions sera étudiée, notamment sur des molécules modèles (métabolites, polluants). Je m’intéresse également au développement d’applications impliquant des matrices moins conventionnelles en MALDI. De nombreuses études en MALDI-MS se sont tournées vers l’utilisation de petites molécules acides comme matrices mais un champ d’application reste encore peu exploré pour l’étude de composés faiblement polaires. J’ai commencé à y travailler avec des chimistes organiciens du laboratoire et différentes voies sont envisagées. En dehors du développement de nouvelles molécules en tant que matrice, c’est également sur l’études des processus MALDI que porte une partie de ce projet. Les propriétés des matrices et des analytes, du laser, de l’environnement physique sont autant de paramètres qui, maitrisés, sont succeptibles de conduire à une meilleure compréhension des mécanismes MALDI et à une modulation des applications associées.
CONCLUSION
Au travers ce manuscrit, j’ai rappelé différents travaux de recherche auxquels j’ai pu contribuer significativement en tant qu’enseignant chercheur au LCP-A2MC, unité de recherche de l’Université de Lorraine.
La spectrométrie de masse par résonance cyclotronique des ions à transformée de Fourier (FT-ICR MS) est la technique d’analyse au cœur de mes activités de recherche. Pousser les limites de cet instrument me permet d’approcher la compréhension moléculaire de la complexité de la matière. Les domaines d’application abordés sont finalement liés à des préoccupations actuelles centrées sur la préservation de nos ressources, l’environnement, l’énergie et le vivant.
Le bilan de mes activités de recherche m’a permis de dresser le contour du projet que je souhaite mener. Elargi à différentes applications liées à la préservation de nos ressources, il intègre des évolutions techniques et méthodologiques en spectrométrie de masse permettant un diagnostic moléculaire d’échantillons toujours plus complexes. Il s’agit du développement de nouveaux couplages (laser, sources d’ionisation, systèmes d’introduction, mobilité ionique), de nouveaux mode de traitement d’échantillons (réactifs, matrices), et de nouvelles séquences de mesures par FT-ICR MS (2D). Indéniablement, mon projet de recherche peut maintenant s’envisager grâce au soutien financier du FEDER, de la région Grand Est, du Conseil Général de la Moselle, et de la communauté de commune Metz Métropole dans le cadre du projet RESEX porté par Frédéric Aubriet et Gabriel Krier.
Ce projet s’appuie sur des collaborations intra- et extra- laboratoire et esquisse une place nouvelle à des activités que je mènerai en toute autonomie. Pour accompagner cette évolution, outre le précieux appui du personnel technique du laboratoire, il est nécessaire de bénéficier du soutien du laboratoire, en me permettant notamment de proposer des sujets de thèse en lien avec mes activités de recherche.
En parallèle à mon projet, je souhaite également poursuivre mon investissement dans le réseau CNRS TGE FT-ICR à très haut champ. Cette approche est scientifiquement très riche parce qu’elle favorise la réalisation de travaux pluridisciplinaires en permettant à des laboratoires extérieurs d’accéder à nos équipements et nos compétences et d’envisager la mise en place de nouvelles collaborations.
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