Application à l’étude de milieux complexes

Etudes par spectrométrie de masse de particules environnementales

Les particules environnementales sont une préoccupation majeure pour la santé humaine et l’environnement depuis la fin du XXème siècle. De nombreuses études ont été consacrées à la recherche des sources, à l’évolution des particules dans l’espace et le temps, à leurs effets sur la santé et sur l’environnement, et aux moyens de remédiation et/ou de protection qui peuvent être mis en place. Pour permettre de guider ces recherches, la caractérisation physique et chimique des particules est un élément important. En particulier, leur capacité d’adsorption et d’induire la condensation en font des vecteurs d’un grand nombre et d’une grande variété de composés.

Les méthodes d’analyse chimiques associant des étapes d’extraction, de séparation et d’analyse permettent de rechercher, d’identifier voire de quantifier un ou plusieurs composés de manière ciblée. Ainsi des traceurs de certaines sources de particules peuvent être recherchés telle que la nicotine pour les particules issues des fumées de cigarette.

Une autre approche consiste à limiter ces étapes de préparation qui peuvent être discriminantes et réaliser une analyse des particules directement sur leur support de prélèvement. Les méthodes de désorption/ionisation laser couplée à la spectrométrie de masse (LDI/MS) offrent la possibilité d’effectuer des analyses in situ de composés spécifiques et/ou d’analyser de manière non-ciblée la composition moléculaire des particules et des composés qui y sont adsorbés.25 Pour certaines particules issues de la combustion de carburant d’origine fossile tel que le diesel, la mise en place de cette approche a permis de mettre en évidence différents HAP avec une signature différente suivant les conditions moteur.26 C’était le sujet principal de ma thèse. J’ai poursuivi le développement de cette approche avec Frédéric Aubriet sur d’autres types de particules. En collaboration avec le Docteur Paul Scheepers du département de toxicologie de la Faculté de Médecine de l’Université Catholique de Nimègue (Pays-Bas), nous avons pu étudier par spectrométrie de masse couplée à l’ablation ou à la désorption laser, la valence du chrome (trivalente ou hexavalente) d’une part et d’autres part étudier la distribution des HAP adsorbés à la surface de particules prélevées en atmosphère de travail d’acieries27.

En ce qui concerne la pollution particulaire de l’air intérieur, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux aérosols émis lors de la combustion du tabac, reconnus comme polluant majeur des espaces confinés28. C’est une matrice éminemment complexe puisque des études ont reporté que plusieurs milliers de composés (organiques et inorganiques) les constituaient. Bien que certains de ces composés soient référencés comme des substances à risque toxicologique important, les études entreprises ne s’intéressent généralement qu’aux espèces les plus volatiles et/ou à certaines classes de composés (amines aromatiques, HAP, nitrosamines,…). Par conséquent, nous avons adopté l’approche non-ciblée afin d’élargir l’étude à une plus grande gamme de composés.

Un programme de recherche et d’étude sur l’analyse exhaustive par FT-ICR MS de particules issues de la fumée de cigarette a pu être mené dans le cadre de deux thèses, réalisées par Sébastien Schramm de 2009 à 2012 puis par Adama Kamissoko de 2015 à 2018. Les premières études ont permis la mise en place d’un dispositif de fumage et de prélèvement des différentes fumées de cigarette.

Ainsi, lors de la procédure de fumage de cigarettes (norme ISO 4387), certains traceurs de la phase gazeuse sont quantifiés par GC-MS/MS afin de valider les conditions de prélèvement. Pour leur part, les particules sont collectées sur des filtres en quartz puis directement analysées par LDI FT-ICR MS (355 nm). Outre la nicotine, un grand nombre de composés carbonés de type CxHyOzNp associés aux particules de fumées de cigarette ont ainsi pu être révélés. L’étude de leur répartition en familles chimiques a permis de différencier les particules inhalées par un fumeur (MMS) de celles émanant de la cigarette entre chaque bouffée (SSS)29,30. Il a ainsi été montré que la traversée du tabac par les fumées permettait le transfert de composés polaires initialement présents dans le tabac. Les fumées émises à l’extrémité de la cigarette quant à elles sont issues plus majoritairement de processus de pyrolyse conduisant à la formation de composés plus aromatiques. En s’intéressant aux fumées exhalées (EXS), il a été observé par cette approche non ciblée que la polarité des molécules entre en considération dans les mécanismes de rétention au sein de l’organisme du fumeur.

Figure 8 Distribution des ions de type CxHyN2^+(•) détectés par (+) ESI et (+) LDI FT-ICRMS dans les particules de fumée du courant principal d’une cigarette française (MMS).

En parallèle, des études ont associé l’approche par LDI FT-ICR MS à celles menée par ESI FT-ICR MS sur des extraits de particules au dichlorométhane (d’autres solvants comme l’hexane et le méthanol ont également été employés). Cette combinaison a permis d’accroitre la connaissance de la diversité moléculaire composés présents dans et sur les particules de la fumée du courant principal (MSS) (Figure 8). Il a également révélé l’influence significative de la présence de certains adjuvants.31,32 Plus particulièrement, nous avons pu

observer que la présence de clou de girofle a pour effet de contribuer à la production de composés issus de la pyrolyse de leur fraction ligno-cellulosique.

Etudes pétroléomiques pour la valorisation de la biomasse

Dans le cadre du développement de ressources énergétiques non-fossiles, la biomasse représente une alternative prometteuse pour la production de biocarburants mais également comme source de produits de base pour l’industrie chimique.33,34 La biomasse rassemble l’ensemble de la matière organique d’origine végétale ou animale. Seulement 3 % de ces ressources sont utilisés mondialement pour l’alimentation humaine et animale35 alors que les produits de leur transformation génèrent une empreinte carbone bien moins élevée que celles des énergies fossiles.

Différentes voies de valorisation de la biomasse sont envisageables. Dans le cadre de la production de biocarburants issues de la biomasse, ceux de seconde génération se prémunissent de la concurrence avec les circuits d’alimentation humaine et animale. Ils sont en effet produits à partir de résidus forestiers36 [8] et agricoles 37 ou encore de cultures dédiées pouvant croître sur des friches industrielles. Les ressources engagées dans la production de ces biocarburants sont communément appelées biomasse ligno-cellulosique en raison de la nature de leurs constituants principaux.

Depuis 2012, nous collaborons avec l’équipe Greener du LRGP, UMR 7274 UL-CNRS et plus particulièrement le Dr Anthony Dufour, sur cette problématique de valorisation de la biomasse lignocellulosique. Spécialistes de la thermo-conversion du bois, ils développent des réacteurs permettant la pyrolyse contrôlée de cette ressource renouvelable. Les produits de la pyrolyse notamment les bio-huiles présentent un potentiel élevé pour le développement de matériaux et d’énergies renouvelables. Cependant, leur utilisation directe est réduite par la complexité importante des constituants des mélanges obtenus. De plus, la forte teneur en oxygène, ainsi que l’acidité de ces bio-huiles sont responsables de problèmes de corrosion et de stockage (instabilité), mais également d’une densité énergétique limitée.38 Pour la production de bio-carburants à partir des huiles obtenues par pyrolyse de la biomasse ligneuse, il est nécessaire de faire subir à ces bio-huiles, des traitements catalytiques de désoxygénation et/ou de craquage39.

Pour guider la transformation de la biomasse, la connaissance aussi fouillée que possible de la composition des produits à chaque étape de traitement est primordiale.

C’est le travail que nous avons entrepris sur certaines bio-huiles obtenues par pyrolyse suivie par une étape de traitement catalytique ou par pyrolyse catalytique. Pour cela, une approche pétroléomique, utilisant la FT-ICR MS en association avec différentes sources d’ionisation, a été conduite. Cette méthodologie a rendu possible la description à l’échelle moléculaire des composés produits et la complémentarité de ces approches assure la description détaillée de bio-huiles.

Ainsi, nous avons pu démontrer que l’ionisation par électronébulisation en mode positif (ESI) ne pouvait s’envisager que dans des conditions contrôlées (utilisation de dopants alcalins) de manière à accroitre la répétabilité et limiter les problèmes de compétition à l’ionisation40. Dans ces conditions, les composés dérivés de la cellulose et de l’hémicellulose ainsi que des lipides et certains dérivés de la lignine sont accessibles et la comparaison de la composition de différentes bio-huiles peut-être conduite.

La photoionisation à pression atmosphérique (APPI) et la désorption-ionisation par laser (LDI) sont plus spécifiques des espèces relatives à la transformation de la lignine16. Appliquée à l’analyse de bio-huiles obtenues par pyrolyse de lignine, la LDI FT-ICR MS en mode d’ionisation négatif a montré l’efficacité de certains traitements d’hydro-désoxygénation sur les produits lourds de type CxHyOz notamment l’utilisation de catalyseurs Fer supporté sur silice41,42 (Figure 9). En effet, de manière similaire aux produits de pyrolyse légers analysés en GC/GC, l’élimination des composés les plus oxygénés est observée au profit de composés de rapports O/C plus faible (Figure 10), validant ainsi l’efficacité du traitement catalytique.

Figure 9 Suivi de l’évolution de la composition d’une bio-huile par LDI FT-ICR MS obtenue par pyrolyse rapide et avec ou sans traitement d’hydro-désoxygénation – distribution en fonction de la classe de composé et suivant les

représentations de van Krevelen

Figure 10 Suivi de l’évolution de la composition d’une bio-huile par GCGC/MS en rouge et LDI FT-ICR MS en violet obtenue par pyrolyse rapide et avec ou sans traitement d’hydro-désoxygénation

Dans le cadre de la pyrolyse catalytique du chêne conduite avec des zéolites HZSM-5 microporeuses ou hiérarchiques (micro et mésoporeuses), l’exploration de la composition chimique des produits lourds par ESI et APPI FT-ICR MS a montré une efficacité améliorée de la désoxygénation par la présence de mésopores43. Plus particulièrement, la description à l’échelle moléculaire a mis en évidence la sélectivité de ces catalyseurs vis-à-vis des dérivés cellulosiques mais également la production de composés purement hydrocarbonés et ce, même pour un plus grand rapport biomasse/catalyseur lors de l’utilisation de zéolites hiérarchiques. La Figure 11 illustre bien la complémentarité de deux sources d’ionisation pour décrire l’évolution des espèces moléculaires au cours de ce traitement. On remarque sur ces diagrammes de Van Krevelen obtenus en ESI(+), après chargement de 7 fractions de biomasse dans le réacteur de pyrolyse contenant le catalyseur, la perte des composés de type cellulosique des biohuiles (A1-7 et B1-7). Cette efficacité semble similaire voire accentuée avec la zéolite hiérarchique (B 1-7). L’APPI(+) pour sa part permet d’observer la lignine pyrolytique qui au cours du traitement révèle la formation de composés moins oxygénés, jusqu’aux hydrocarbures non-oxygénés observés le long de l’axe des ordonnées (Figure 11).

Figure 11 Diagrammes de van Krevelen de bio-huiles analysées par ESI et APPI FT-ICR MS obtenues par pyrolyse (Raw B.O.) et par pyrolyse catalytique avec Zéolithe H-ZSM-5 (A1-7) et H-ZSM-5 hiérarchique (B1-7)

Au-delà de la caractérisation des produits de la pyrolyse de la biomasse ligno-cellulosique, l’étude de la complexité moléculaire des matériaux bruts est également un challenge pour la spectrométrie de masse. Dans ce sens, deux approches ont été initiées. La première consiste à étudier des lignines extraites du peuplier et du pin Douglas.44 Les analyses MALDI FT-ICR MS ont permis de partiellement révéler de nombreux oligomères. Cette étude réalisée en collaboration le LRGP et l’Université Pullman (Washington – USA) a pu confronter ces résultats à des simulations de structures de la lignine. Ainsi, des propositions cohérentes de structures de lignines ont pu être proposées pour expliquer les données expérimentales obtenues. Cette construction de librairies est particulièrement intéressante à poursuivre et apporte une dimension structurale supplémentaire aux données MS de ces matériaux complexes. La deuxième approche entreprise est associée à l’analyse du bois brut, découpé en fins copeaux, par LDI FT-ICR MS.45 Ici, ce sont les paramètres de l’interaction laser-matière qui vont guider les informations moléculaires qui sont révélées. La longueur d’onde (355 nm et 266 nm) et la fluence du laser ont montré une influence significative sur la génération des ions. Des processus thermiques et photochimiques s’établissent. Suivant les conditions laser, la balance entre ces processus conduit à des profils moléculaires associant la pyrolyse de différents constituant du bois, qui s’apparente, soit à des composés typiques de bio-huiles pyrolytiques, soit à des composés de type charbon issue de la biomasse. L’intérêt ici est de pouvoir par cette technique rapidement caractériser et classer une biomasse pour les composés qu’il est susceptible de générer lors d’une pyrolyse classique.

Etudes par spectrométrie de masse de matrices biologiques

A mon arrivée en 2007 au laboratoire, une thématique centrée sur le développement méthodologique en spectrométrie de masse dans le domaine des plantes émergeait sous l’impulsion de Benoit Maunit et Jean-François Muller. Suite à la promotion de Benoit Maunit à l’Université d’Orléans et le recrutement de Patrick Chaimbault sur un poste de professeur au laboratoire, nous nous sommes engagés Patrick et moi sur le développement de cet axe.

Je me plus particulièrement impliqué dans l’étude des métabolites de la vigne lorsqu’elle est soumise à un stress induit par un pathogène tel que le mildiou (Plasmopara viticola). Ce projet s’inscrit dans un contexte environnemental fort. L’utilisation massive de traitements phytosanitaires est souvent considérée comme une nécessité pour limiter les risques de maladies telles que le mildiou. L’impact n’est cependant pas sans effet sur les écosystèmes et sur les souches elles-mêmes. Une alternative consiste à accélérer le processus de sélection et d’augmenter les chances d’obtenir des variétés à résistance durable acceptées par la filière viticole et la société. L'inventaire des sources de résistances disponibles, leurs bases génétiques et moléculaires et les mécanismes de résistance et de défense mis en jeu, mais aussi le potentiel évolutif des pathogènes doivent alors être considérés. Ce travail a été mené en collaboration avec le laboratoire de génétique et d’amélioration de la vigne (INRA de Colmar, UMR 1131) et une première thèse financée par le Centre Interprofessionnel des Vins de Bordeaux (CIVB) a permis d’apporter des données intéressantes (thèse de Grégory Hamm). Dans ce cadre, deux approches complémentaires ont été mises en place. La première associée au développement de l’imagerie par spectrométrie de masse (IMS) a permis d’identifier et de localiser sur des feuilles de vignes infectées par le mildiou certaines phytoalexines, des composés stilbéniques ayant un rôle antifongique (resvératrol et ptérostilbène), à proximité des sporanges46. L’approche mise en place est basée sur la désorption/ionisation laser. La focalisation des impulsions laser sur une surface sphérique d’une dizaine de micromètre de diamètre de la feuille préalablement lyophilisée a permis d’obtenir des images de répartition de certains composés avec des résolutions latérales de l’ordre de 25 µm. Nous avons pu montrer qu’en travaillant à 266 nm (laser Nd :YAG quadruplé en fréquence), ces composés stilbéniques de faible taille sont photo-ionisés et détectés avec une grande sensibilité sous la forme d’ions radicalaires moléculaires M+.

La deuxième démarche entreprise est une étude non-ciblée des extraits méthanoliques de feuilles de vigne par spectrométrie de masse à très haute résolution (ESI FT-ICR MS et spectrométrie de masse en tandem MS/MS). Plusieurs familles de composés ont pu être identifiées (flavonoïdes, dérivés des acides hydroxycinnamiques, saccharides, phospholipides). L’évolution de ces composés a été suivie pour différentes variétés de vigne issues de croisements et de cépages et présentant des sensibilités différentes au pathogène Plasmopara viticola (thèse de Loïc Becker). Bien qu’il soit encore délicat d’identifier des facteurs de résistance, l’analyse en composante principale de ces données (issues de plus de 200 échantillons relatifs au croisement entre variétés résistantes et sensibles) a permis d’observer une ségrégation des individus en fonction de la présence ou non du pathogène(Figure 12).47

Figure 12 Comparaison des empreintes métaboliques par ESI FT-ICR MS de feuilles de vigne saines ou infectées par Plasmopara viticola

Durant la thèse de Loïc, l’imagerie par spectrométrie de masse (IMS) de feuilles de vigne a pu progresser et se conforter. Dans un premier temps, une approche combinée de deux techniques d’imagerie sensibles à des propriétés différentes des stilbènes a pu être réalisée sur une même feuille (Figure 13) : la fluorescence et l’IMS48. Cette approche combinée nous a permis de confirmer/valider la distribution spatiale et la présence relative (semi-quantitative) des stilbènes dans le cas d'une infection d'une même feuille de vigne tout en mettant en avant les limitations de chaque technique (fragmentation en MS de certains stilbènes non observables / signal de fluorescence provenant également d'autres molécules que les stilbènes et sensible à la rigidité du milieu environnant).

Figure 13 Image moléculaire de diacylglycérols d’une feuille de vigne par IMS (gauche) et images combinées obtenues par fluorescence et par IMS d’une même feuille de vigne infectée partiellement par un pathogène.

Le mode d’imagerie a également pu commencer à s’étendre à d’autres métabolites que ceux précédemment identifiés par l’utilisation d’une matrice (mode MALDI)49. Cette étude préliminaire a été réalisée sur des feuilles de Cabernet Sauvignon ayant subies un stress biotique (infection par Plasmopara viticola) ou abiotique (3 min irradiation UV-C). Bien que le dépôt ait été réalisé manuellement, la matrice 2,5-DHB a

permis d’assurer la détection et la localisation de certaines viniférines (contribution de tous les isomères) sur les parties stressées de ces feuilles. Cette étude préliminaire est particulièrement intéressante puisque que certains de ces polyphenols stilbéniques possèdent une activité antifongique beaucoup plus élevée que le resvératrol.50 D’ailleurs, certains produits commerciaux tel que le produit phare du moment de la société Caudalie, associe la viniférine à leur formulation « Vino Perfect », une solution antitache pour la peau vendue comme particulièrement efficace pour son activité anti-oxydante.

L’étude de matrices biologique constitue une part de mes activités de recherche non seulement pour permettre une meilleure compréhension des interactions entre organismes mais également pour ouvrir des voies de valorisation de leurs produits et/ou constituants. Dans cette optique, avec Patrick Chaimbault, nous poursuivons actuellement un travail d’étude dans le cadre du projet InterReg « Bioval » en partenariat avec des laboratoires et entreprises allemands, belges et luxembourgeois de la Grande Région. Les forces de ce consortium sont la complémentarité des compétences pour développer de nouveaux produits et formulations à haute valeur ajoutée pour les secteurs alimentaire, chimique, pharmaceutique et cosmétique. Plus particulièrement, ce projet vise à la mise en place d’une filière de valorisation transfrontalière des drêches de brasserie, un déchet produit en grande quantité lors de la fabrication de la bière. Pour notre part, nous avons conduit des analyses des drêches et de leurs extraits par une approche non ciblée. Dans ce cadre, nous avons travaillé avec Ali Zaiter, recruté pour la durée du contrat. Nous avons ainsi pu identifier différentes familles de molécules notamment des lipides complexes et des polyphénols. L’optimisation des conditions d’extraction a permis également d’identifier et quantifier certains de ces composés possédant un potentiel intéressant pour la pharmaceutique, notamment certains phospholipides cycliques (publication en préparation).

Etudes par FT-ICR MS de macromolécules

Depuis quelques années dans le cadre de différents projets du réseau TGE FT-ICR, nous nous sommes intéressés à pousser les limites de la spectrométrie de masse à très haute résolution pour l’étude de macromolécules auto-assemblées. Une collaboration avec le Dr Sébastien Goeb et le Prof. Marc Sallé du laboratoire MOLTEC-Anjou de l’Université d’Angers s’est établie.51–55 Elle repose sur la caractérisation de complexes métal–ligand macromoléculaires qui s’auto-assemblent et conduisent à la formation d’édifices tridimensionnels disposant d’une cavité de dimension contrôlable capable de piéger un invité. La libération de cet invité est réalisée au travers d’une stimulation de type Redox. Ces études permettent d’envisager par exemple, le transport de composés actifs dans l’organisme avant leur libération de manière ciblée. Au-delà