Etudes de mélanges complexes par des approches non-ciblées

De manière complémentaire aux études consacrées à la recherche voire la quantification de quelques composés connus dans des mélanges, les études non-ciblées consistent à mettre en place des analyses moléculaires sans a priori. L’idée est donc d’analyser tout ce qui est possible avec une ou plusieurs techniques et de systématiquement considérer tous les signaux mesurés. Cette approche est particulièrement intéressante pour étudier de manière détaillée la globalité d’un système permettant ainsi l’observation de toutes modifications consécutives à une action (maladie, contamination, irradiation, traitement chimique ou thermique, modification de l’environnement, …).

Différentes techniques analytiques peuvent être envisagées telles que la RMN ou la spectrométrie d’absorption IR ou RAMAN, mais seule la spectrométrie de masse est capable d’apporter des informations sur la composition chimique élémentaire des molécules d’un mélange. Pour que cette approche apporte autant d’information moléculaires sur un mélange, le spectromètre de masse doit posséder des performances élevées. Idéalement, le spectromètre de masse doit être suffisamment sensible pour détecter un grand nombre de composés aux propriétés physico-chimiques différentes et présents en quantités variables sur une large gamme de masse. Il doit également permettre la mesure précise de masse, y compris pour des composés de masses très proches. Les spectromètres de masse à très haute résolution (HRMS) répondent en grande partie à ces exigences puisqu’ils possèdent un très haut pouvoir de résolution (plusieurs centaines de milliers) et une très haute précision de la mesure de masse (de l’ordre du ppm).

L’approche non-ciblée par HRMS est au cœur de mes activités de recherche. Plus spécifiquement, le développement de méthodes d’analyse non-ciblée par spectrométrie de masse à résonance cyclotronique des ions et à transformée de Fourier (FT-ICR MS) m’a permis de contribuer à la description détaillée de la composition chimique de mélanges complexes. Les parties suivantes décrivent de manière générale, l’analyse non-ciblée par spectrométrie de masse en précisant les avantages et limitations de cette approche, les mesures par spectrométrie de masse FT-ICR et les outils de traitement de données.

L’analyse non-ciblée de mélanges complexes par spectrométrie de masse

D’un point de vue général, un spectromètre de masse fonctionne avec dans l’ordre, un système d’introduction de tout ou partie d’un échantillon, une source d’ionisation, un analyseur de masse et un détecteur. Cette chaine d’éléments et d’évènements peut être choisie et adaptée à la mesure de la masse d’un composé donné (analyse ciblée). Dans le cadre de l’analyse non-ciblée d’un échantillon, idéalement, la masse de tous ses constituants est mesurée. En pratique, ce n’est jamais le cas pour les mélanges complexes. Chaque élément du spectromètre de masse a une action qui peut être discriminante et seule une partie des constituants d’un mélange est réellement accessible. Différents facteurs vont influer :

- la nature, l’état, la forme, la réactivité et la quantité d’un échantillon ;

- les propriétés physiques et chimiques des composants de l’échantillon (absorption, pression de vapeur saturante, polarité, solubilité, interactions, stabilité) ;

- les caractéristiques de la source d’ionisation (fonctionnement, configuration, linéarité, gamme dynamique, sensibilité, stabilité) ;

- les performances de l’analyseur et du détecteur des ions (résolution, précision de mesure, gamme dynamique, gamme de masse, sensibilité, temps de réponse).

Finalement, l’analyse non-ciblée d’un échantillon par spectrométrie de masse permet une couverture partielle plus ou moins large de sa composition suivant la combinaison de ces éléments. Le choix est donc guidé par la problématique qui conduit à l’analyse et bien sûr, par le matériel disponible en laboratoire. Différentes stratégies d’analyse peuvent être mises en place pour permettre l’étude d’un grand nombre de molécules d’un échantillon suivant sa nature. Elles consistent à:

- simplifier l’échantillon en n’étudiant qu’une partie (extraits, fractions) - adapter la concentration de l’échantillon et la composition du solvant

- utiliser en amont du spectromètre de masse, un système de séparation chromatographique (GC, LC, GPC, SFE)

- modifier les propriétés d’un échantillon (ajout de matrice, ajout d’un dopant)

- mesurer la masse des ions avec un spectromètre de masse à très haute résolution (FT-ICR MS, Orbitrap).

- adapter la source d’ionisation à une large gamme de composés d’intérêt.

Nous nous inscrivons au laboratoire dans ces approches, centrées principalement sur l’utilisation de spectromètres de masse de très haute résolution. La nécessité de travailler avec ces outils pour des analyses non-ciblées est clairement établie.1 Depuis plus de 30 ans, le laboratoire est reconnu pour son expertise en spectrométrie de masse à résonance cyclotronique des ions et à transformée de Fourier (FT-ICR MS). Depuis mon arrivée au laboratoire, je travaille plus particulièrement à la mise en place de méthodes d’analyse non-ciblées sur ces instruments, une approche qui est maintenant qualifiée de pétroléomique.2 En effet, ces instruments rendent possible la mesure simultanée, avec une haute précision, d’un grand nombre d’ions de rapport m/z différents. Il est alors envisageable d’étudier un échantillon « brut » en limitant les étapes de préparation, représentant un risque d’altération de son intégrité. On obtient ainsi une « empreinte moléculaire » partielle mais détaillée d’un échantillon. Après avoir donné le principe de fonctionnement de

la FT-ICR MS, je détaillerai quelques représentations en cartes moléculaires qui permettent, à partir d’un spectre de masse de très haute résolution, de traduire les informations spectrales.

Principe du spectromètre de masse à résonance cyclotronique d’ions et à transformée de Fourier

Le principe de fonctionnement d’un spectromètre de masse à résonance cyclotronique d’ions et à transformée de Fourier (FT-ICR MS) repose sur la propriété qu’a un ion, se déplaçant dans un champ magnétique uniforme B0, à adopter une trajectoire circulaire et uniforme3.

Ce mouvement est appelé mouvement cyclotron dont la pulsation c pour un ion de masse m et de charge q=z.e plongé dans un champ magnétique B0 est donnée par l’équation suivante :

𝜔_𝑐 = ^{𝑞 × 𝐵0}

𝑚 ⁼

𝑒 × 𝐵₀ (^𝑚_𝑧)

Ce mouvement confine l’ion dans un plan perpendiculaire à l’axe du champ magnétique B0. Afin de réaliser une mesure à l’aide de ce spectromètre de masse, il est nécessaire que les ions soient piégés dans les trois dimensions de l’espace. Pour contraindre les ions dans la troisième dimension (celle correspondant à l’axe du champ magnétique), un puit de potentiel est généré en appliquant sur deux plaques, dites de piégeages, perpendiculaires à B0, un potentiel de l’ordre du volt. Le mouvement des ions peut de manière simple être considéré comme la combinaison d’un mouvement de rotation autour de l’axe du champ magnétique (mouvement cyclotron) et d’un mouvement oscillant au centre du puit de potentiel (oscillation de piégeage). La fréquence de giration, dépendant de la valeur de B0, est comprise entre quelques dizaines de kHz et quelques MHz pour des ions possédant des rapports m/z compris entre 150 et 2500 dans un champ magnétique de 9,4 T.

Ces deux plaques de piégeage constituent les extrémités de la cellule FT-ICR, également appelée piège de Penning (de forme cylindrique sur les instruments actuels, il est bon de préciser que d’autres géométries de cellules ont été développées4–6). C’est au sein de ce piège que la mesure du rapport m/z des ions est réalisée (Figure 1). Celle-ci se réalise en deux temps. L’énergie cinétique des ions est augmentée par résonance entre leur mouvement de giration et un champ radiofréquence appliqué sur 2 plaques opposées de la cellule (excitation dipolaire). Celui-ci est constitué de la superposition de fréquences comprises entre quelques kHz et quelques MHz. Cet accroissement d’énergie cinétique conduit à une augmentation du rayon de la trajectoire des ions qui sont initialement au centre de la cellule. Cette étape d’excitation a également pour effet d’augmenter la cohérence du mouvement des ions de même rapport m/z. Après l’arrêt de l’excitation par radiofréquence, le mouvement des ions se stabilise sur une orbite haute, proche des plaques qui constituent la cellule FT-ICR. Leur mouvement étant cohérent et donc en phase, les ions de rapport m/z donnés induisent lorsqu’ils passent à proximité des plaques de détection (classiquement 2 plaques opposées de la cellule), un courant alternatif image de fréquence égale à la fréquence de leur mouvement de giration.3 Le signal mesuré est un interférogramme correspondant à la combinaison des fréquences de giration de tous les ions présents dans la cellule quel que soit leur rapport m/z (Figure 1). Ce signal décroit exponentiellement avec le temps du fait d’une perte de la cohérence du mouvement cyclotronique au travers de processus collisionnels et/ou d’interactions électrostatiques. L’application de la transformée de Fourier permet le passage du domaine du temps à celui des fréquences, puis à celui des rapports m/z par calibration (approchant l’équation f=(eB0)/(2π m/z)). La présence simultanée d’un champ électrique et d’un champ magnétique ne permet cependant pas d’obtenir de manière aussi simple le rapport m/z. En effet, ces deux champs combinent leurs effets pour donner naissance à un mouvement appelé magnétron. On pourra se reporter aux équations exactes de ces mouvements décrites dans différents articles de mise au point précédemment cités.5–7

La stabilité des champs magnétiques élevés (aimants supraconducteurs de quelques Teslas) et l’ultra-vide atteint dans la zone de mesure (environ 10-10 mbar) permettent de mesurer le signal sur un temps suffisamment long (plusieurs secondes) pour atteindre des pouvoirs de résolution en masse de plusieurs millions et des mesures de masse d’une précision inférieure au ppm (avec un nombre de points d’échantillonnage du signal allant jusqu’à 16M). Ces performances font du spectromètre FT-ICR MS une référence de mesure de masse d’atomes et molécules.

Transfert source d’ionisation – Cellule

Outre sa capacité à être utilisé comme un réacteur d’étude des ions piégés pendant plusieurs secondes, ce spectromètre de masse possède des interfaces permettant le couplage de différentes sources d’ionisation, qui, nous allons le voir, est un avantage considérable dans le cadre d’une approche de type pétroléomique. Il intègre nécessairement des éléments de transfert des ions de la source d’ionisation (externe), qui peut être à pression atmosphérique (ESI, APPI,…), vers la cellule d’analyse qui est placée dans un vide poussé. De plus, le spectromètre fonctionnant de manière séquentielle, les ions générés par des sources continues ou discontinues doivent être stockés sur un temps donné avant d’être introduits dans la cellule ICR.

La plupart des instruments sont alors assez volumineux. A l’encombrement de l’aimant supraconducteur, il faut ajouter la disposition des sources hors des lignes du champ magnétique. Plus précisément, une succession de lentilles et multipoles (hexapoles, « ion funnels », quadrupole) conduisent les ions à travers des zones de pompage différentiel jusqu’à un hexapole dans lequel les ions sont piégés (puit de potentiel de quelques volts, balayé par un gaz de thermalisation tel que l’argon). Après un temps déterminé (de quelques ms à quelques s), une vanne isolant la zone d’ultra-vide s’ouvre et les ions stockés sont accélérés et parcourent une ligne de transfert (hexapole d’une longueur l’ordre du mètre) avant d’arriver dans la cellule ICR, située au centre de l’aimant et dans le vide poussé (10-10 mbar).

Ce transfert des ions est particulièrement influant sur l’étude d’échantillons complexes. Au cours de ce processus, la perte ou l’enrichissement en certains ions est susceptible de se produire. Premièrement, les ions qui atteignent la cellule ICR doivent rester stables pendant au moins plusieurs dizaines de millisecondes. Deuxièmement, chaque élément guidant ou stockant les ions possède, en fonction des valeurs consignes qui leurs sont appliquées (potentiels, fréquence), une capacité de transfert variable pour une gamme de masse considérée. Et enfin, le temps de transfert des ions entre l’hexapole de stockage et l’entrée dans la cellule ICR (« temps de vol ») contraint l’étude sur une gamme de m/z restreinte. Finalement, l’interprétation d’un résultat doit prendre en compte l’influence de ces différentes étapes subies par les ions depuis la source jusqu’à la cellule d’analyse.

Spectromètres FT-ICR MS du laboratoire

Le laboratoire a été un des premiers laboratoires français à s’équiper d’un spectromètre de masse de ce type en 1984. A partir des années 80, un prototype à 3T de la marque Nicolet a été développé pour y permettre le couplage d’une microsonde laser. Puis en 2005, un appareil FTICRMS IonSpec (Varian) à 9,4T a été installé. Outre des performances améliorées, il a offert la possibilité d’utiliser différentes sources d’ionisation notamment celles à pression atmosphériques. En 2019, le projet Resex soutenu par l’Europe, la Région Grand-Est, le département de la Moselle et Metz Metropole a permis l’installation du premier FT-ICR MS à 7T équipé à la fois d’une cellule harmonisée et de la technologie 2XR (permettant de doubler la vitesse d’analyse à résolution équivalente).

Quelques caractéristiques de ces trois instruments sont précisées dans le Tableau 7.

Tableau 7 Caractéristiques des différents spectromètres FT-ICR du laboratoire entre 1984 et 2020

La plupart les travaux présentés ici ont été réalisés à l’aide du spectromètre FT-ICR MS IonSpec de 9,4 T. Particularités du couplage laser

L’utilisation standard du laser en spectrométrie de masse consiste à générer des ions à partir de l’irradiation par une impulsion laser de la surface d’un échantillon. Deux régimes peuvent être considérés en fonction de la fluence laser (énergie par unité de surface en J.cm-2) ou de la densité de puissance laser également nommée irradiance (W.cm-2). À une faible fluence laser, la désorption / ionisation laser (LDI) peut avoir lieu. Lorsque la fluence laser augmente, le régime d'interaction laser-matière est modifié et conduit à l'ablation. Dans les deux cas, le phénomène d'ionisation et le transfert des atomes ou des molécules à la phase gazeuse sont directement le résultat de l'interaction laser-matière. LDI et LA sont bien adaptés à l'analyse d'une large gamme de composés organiques, inorganiques et aussi biologiques. Pour matrices complexes, des informations peuvent être obtenues à la fois sur les espèces organiques et inorganiques.

Présenté de cette manière, l’utilisation d’un laser parait simple et adaptée à l’étude d’échantillons solides même placés sous vide, l’impulsion laser pouvant être guidée par des systèmes optiques. Cependant, de

Marque Nicolet IonSpec (Varian) Bruker

Champ Magnétique 3T 9,4T 7T

Cellule double cellule cubique cellule cylindrique ouverte cellule cylindrique harmonisée Excitation SWIFT SWIFT/SWEEP SWEEP

Sources d'ionisation ^{interne :}

microsonde laser / EI

externe (2 modules) : MALDI - EI (10-7mbar) / ESI

externe :

MALDI (5 mbar) / ESI/ APCI / APPI / DART

Laser Nd:YAG (3w, 4w), colorant, excimer Nd:YAG (3w, 4w, 5w) Nd:YAG (3w) (4w et 5w en prévision) Mode de

fragmentation ^{CID SORI, CID, ECD, IRMPD}

Collision Cell, ECD, SORI (IRMPD en prévision)

Transfert des ions conductance limite (entre 2 cellules) ^{cones + hexapole + quadrupole +} hexapole de stockage + hexapole

capillaire + ion funnels + quadrupole + hexapole de stockage + hexapole Fréquences (kHz)

m/z =100-5000 ^{325 - 6,5 (w) 1000 -20 (w)}

750 - 15 (w) 1500 - 30 (2w)

nombreux facteurs vont influer sur la possibilité de générer des ions et sur leur nature. Le laboratoire travaille depuis plus de 30 ans sur le développement de nouvelles applications associant la spectrométrie de masse et les lasers, et sur la compréhension des mécanismes associés permettant la formation des ions.8–11

Comme nous l’avons précisé dans une revue publiée récemment,12 la combinaison d’une source laser avec la FT-ICR MS démultiplie les performances de ce couplage. La majorité de la zone irradiée d’un mélange complexe pouvant conduire à un grand nombre d’ions de masses différentes, la haute résolution et précision en masse apportent la confiance nécessaire à l’attribution. La polyvalence des sources laser en termes d'énergie et de longueurs d'onde assure un contrôle fin des processus intervenant lors des interactions laser – matière. De nombreuses applications sont alors accessibles, notamment par l’utilisation de diverses matrices (MALDI). De plus, le fonctionnement en mode microsonde laser permet de ne détecter que les ions issus de l’irradiation laser d’une zone restreinte et localisée d’un échantillon. L’exploration des potentialités du couplage laser – MS est un axe de recherche toujours actif au laboratoire.

Traitement et exploitation des données MS

L’obtention d’un spectre de masse présentant des milliers de pics de masse n’est pas une fin en soi et différentes étapes sont nécessaires pour accéder à l’information qu’il contient. Le but est alors de permettre la détermination de la composition élémentaire associée à tous les signaux mesurés.

Dans un premier temps, une étape de calibration interne doit être menée pour permettre d’obtenir la précision en masse la plus élevée possible sur toute la gamme de masse. L’idée ici est d’obtenir une attribution d’une formule brute pour chaque pic de masse avec une confiance élevée, la calibration externe restant discutable. En effet, le nombre de combinaisons d’atomes correspondant à une masse mesurée peut devenir extrêmement élevé si la précision de la mesure reste faible. Un exemple de l’étendue de ce nombre en fonction de l’erreur tolérée est donné dans le Tableau 8 lors de la recherche de formules répondant à m/z = 527,15826 en limitant la recherche aux éléments C0-100H0-100N0-100O0-100S0-100Na1⁺ et aux combinaisons qui respectent les « sept règles d’or ».13 En prenant en compte une précision de mesure qui varie entre 8 ppm et 0,1 ppm, 235 propositions sont réduites à 3 propositions. C’est donc une nécessiter de travailler à très haute précision de mesure de masse. Cependant, cet exemple indique clairement que ce n’est pas suffisant, il reste encore trois propositions et tous les éléments n’ont pas été recherchés. D’autres stratégies peuvent alors être adoptées, elles seront décrites dans les paragraphes suivants.

Tableau 8 : Nombre de formules CHNOSNa proposées en fonction de l’erreur de mesure de masse tolérée (en ppm) Erreur (ppm) #Formules 0.1 3 0.5 13 1 27 2 53 3 81 4 111 5 144 6 175 7 204 8 235

Concernant la calibration, la plupart des articles ne le précise que rarement mais différentes approches peuvent être mises en œuvre.14 Idéalement, la fréquence mesurée est inversement proportionnelle à la masse. L’équation de calibration serait : m/z=A/(f) avec A une constante de calibration qui associe la fréquence de mesure f au rapport m/z d’un ion.

Cependant, pour tenir compte de l’influence du champ de piégeage et des charges d’espace, un deuxième terme est pris en compte : m/z=A/f + B/f2. Cette formule est la plus couramment utilisée mais peut présenter des distortions liées à des populations d’ions très différentes, les charges d’espace étant considérées comme globales.

Dans ce cas, pour tenir compte du déplacement des fréquences observées en fonction de la quantité d’ions, un troisième terme dépendant de l’intensité mesurée pour chaque ion peut être ajouté :

(m/z)i = A/f + B/f2 + C*Ii/f2 avec Ii l’intensité de l’ion à (m/z)i¹⁵

Dans le cas des analyses type « pétroléomiques », la calibration interne s’effectue sur des séries d’ions qui ne diffèrent que par le nombre de groupements méthylènes (CH2) sur toute la gamme de masse étudiée et/ou des familles de composés générant des pics de masse bien identifiable sur le spectre (ex : acides gras en mode négatif). Typiquement, les erreurs sur la calibration d’un spectre se distribuent comme cela est reporté sur la Figure 2.

Figure 2 : Distribution des erreurs de mesures de masse après recalibration interne d’un spectre (+)APPI FT-ICR MS d’une bio-huile16

La présence d’hétéroatomes et d’insaturations a un effet sur la masse d’un ion et plus finement sur son défaut de masse qui peut être décrit de manière simple comme la différence entre la masse exacte et la masse nominale. Il peut être particulièrement intéressant de suivre ce paramètre dans le contexte d’analyses non-ciblées. Le schéma présenté sur la Figure 3 indique les défauts de masse exprimés en mDa de quelques nucléides. Ces différences vont dans le cas de mesures de très haute résolution et de très grande précision de masse permettre d’aider à l’attribution du plus grand nombre de signaux.

-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 50 150 250 350 450 550 650 750 mass e rr o r (p p m) m/z

Figure 3 Défaut de masse de quelques nucléides dans l’échelle IUPAC17

Par ailleurs, la représentation des défauts de masse par rapport aux masses nominales donne un aperçu rapide qu’on peut qualifier d’empreinte moléculaire. Par convention, la masse IUPAC est définie par rapport à l’isotope 12 du carbone : m12C=12 Da. Dans le cas de mélanges complexes, il peut être intéressant de baser l’échelle de masse sur une autre référence que 12C. C’est particulièrement le cas si une série d’ions ne sont séparés les uns des autres par un même motif comme CH2, ou dans le cas d’un polymère, unité répétitive (C2F4, C2H4, …)

La masse et le défaut de masse de tous les ions analysés seront alors modifiés. Dans le cas d’une référence CH2, les masses et défauts de masse sont dits de Kendrick.18,19 Ce groupement méthylène, de masse