Perspectives: Investiguer FMRP plus en profondeur dans ce modèle

11.1.1. RNA-Sequencing (Illumina)

Nous avons vu que FMRP liait des larges complexes polyribosomaux composés non seulement des RBPs régulateurs de la traduction protéique, mais aussi de molécules permettant le transport de ces complexes aux sites de synthèse protéique locale. De plus, elle semblait se déplacer en présence de certains éléments de la machinerie traductionnelle comme les facteurs d’initiation. Mon hypothèse était que dépendamment du type cellulaire en différenciation, ces complexes ribonucléoprotéiques cibleraient des ARNm importants requis dans la maturation et à la spécification des cellules progénitrices. Dans les neurones, ces ARNm cibles avaient été identifiés comme étant impliqués dans la formation du réseau synaptique (protéines d’échafaudage, stabilisateurs du cytosquelette, récepteurs de neurotransmetteurs, etc.) (Kindler & Kreienkamp, 2012). Toutefois, les MEG-01 possèdent un éventail d’ARNm qui leur est propre afin de se différencier en des cellules matures différentes des neurones de par leur morphologie, leur fonction, ainsi que par leur contenu biomoléculaire. Ceci signifie que les ARNm dont la synthèse locale sera requise pour

permettre la maturation des proplaquettes, spécifique aux MEG-01, seront différents de ceux qui ont été identifiés dans les mRNP neuronaux transportés aux dendrites. Malgré ces différences surgissant au nom de la spécificité cellulaire, il est très probable que les familles d’ARNm ciblées soient similaires d’un tissu à l’autre, attribuant aux complexes mRNPs régulateurs un rôle universel qui s'appliquerait à tous les types de cellules en différenciation. Ainsi, nous serions en mesure d'anticiper les effets à plus grande échelle d'un débalancement de ces complexes régulateurs fonctionnels et de leur transport intracellulaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes derrière les anomalies développementales qui résulteraient d'un tel débalancement, il serait important de déterminer les ARNm retrouvés dans les polyribosomes par séquençage d’ARN à l’aide du système Illumina. Une première analyse dans les MEG-01 en prolifération permettrait de déterminer les cibles initiales des complexes mRNPs, et une seconde analyse pour les MEG-01 différenciés rendrait possible la comparaison de ces cibles d’ARNm pour déterminer si elles changent durant la différenciation cellulaire. En toute probabilité, comme dans les neurones, il y aurait un enrichissement des ARNm impliqués dans le développement cellulaire (Castrén, 2006). Si on se fie aux niveaux protéiques changeants que nous avons déterminés par FACS dans les MEG-01, l’ARNm de la B-tubuline entre autres serait potentiellement enrichie dans les MEG-01 en différenciation. Ceci confirmerait bien que les ARNm ciblés, régulés et transportés par les complexes mRNPs sont sélectionnés selon leur rôle fonctionnel dans la différenciation cellulaire et le développement.

11.1.2. siRNA contre FMR1

Afin de mieux comprendre le rôle et l’importance de FMRP dans le processus de différenciation cellulaire un modèle knockout ou knockdown de FMR1 pourrait être utilisé. La façon la plus simple que nous avions envisagé était de se servir d'un siRNA dirigé contre FMR1 dans les MEG-01. Par transfection des MEG-01 avec un siRNA, un court duplexe d’ARN qui vient lier les ARNm de FMR1 pour empêcher sa traduction en FMRP, nous cessons l’expression de FMRP dans la cellule pour obtenir un « modèle SXF ». Ainsi, nous serions en mesure de déterminer les effets d’une perte de fonction de FMRP dans la différenciation des MEG-01 en se servant des mêmes méthodes utilisées dans notre article.

Il serait donc possible de vérifier si la morphologie des MEG-01 est affectée durant le processus de différenciation. De plus, nous pourrions vérifier si les PLPs sont toujours produites, si le déplacement des polyribosomes a toujours lieu ou non dans les MEG-01 induits et si leurs propriétés ont changées i.e. sensibilités aux détergents. Notre hypothèse est que l’absence de FMRP aurait peu d’effets sur ces phénomènes de base. Toutefois, nous aimerions vérifier l’effet sur le taux de synthèse protéique totale et de-novo. Sachant que FMRP est un répresseur de la traduction, on pourrait s’attendre à un taux de synthèse plus élevé dans les cellules en différenciation. C’est-à-dire que la différence de taux de synthèse entre les cellules en prolifération et en différentiation serait moins importante. L’expérience ultime permettant de mieux apprécier le rôle de FMRP dans la modulation du transport et de la synthèse protéique serait de comparer les ARNm, tel que décrit précédemment, entre les MEG-01 différenciés natifs et ceux en présence de siRNA. Ainsi, nous serions en mesure d’identifier quelles sont les ARNm en particuliers qui sont affectés par l’absence de FMRP. Nous pensons que ces ARNm coderaient pour des protéines jouant un rôle important dans l’architecture fine de la différenciation un peu comme dans les neurones où son absence cause la formation d’épines dendritiques longues et immatures.

11.1.3. Étude de FMRP et des mRNPs dans d'autres modèles

Finalement, afin de démontrer que les fonctions de FMRP dans la différenciation cellulaire des MEG-01 et des neurones sont vraiment universelles, d'autres modèles de différenciation cellulaire développementaux, tels que la différenciation des cellules intestinales par exemple pourraient être testées. FMRP devrait aussi être déplacée dans ces cellules si la synthèse protéique locale est requise (donc quand une asymétrie est développée).Un autre type de modèle où FMRP pourrait effectuer une fonction active serait dans les cellules qui se servent de filopodes afin de se déplacer dans l'environnement. FMRP semble être importante dans l'élongation d'extensions cytoplasmiques par la régulation qu'elle exerce sur la synthèse et l'apport des protéines stabilisatrices du cytosquelette. Puisque le cytosquelette se réorganise de façon importante durant la motilité cellulaire, tout comme dans la formation de dendrites ou de proplaquettes, le maintien de l'équilibre dynamique de polymérisation et de dépolymérisation est un facteur critique dans l'acquisition de la morphologie visée. L'absence de FMRP dans les dendrites résulte en une morphologie

anormale. Si l'inhibition du gène FMR1 dans les MEG-01 résultait similairement en une formation anormale des proplaquettes, ces cellules motrices ne pourraient plus former et bouger leurs filopodes correctement. Donc, l'inhibition de FMR1 pourrait potentiellement réduire leur potentiel motile de façon directement proportionnelle à la réduction d'expression de FMRP.

En absence de FMRP, la perte de motilité, ainsi que l'effet déstabilisant sur la différentiation cellulaire sont deux phénomènes qui supporteraient d'avantage notre hypothèse sur les fonctions communes de FMRP dans tout tissu. Ces fonctions générales en tant que RBP permettant la synthèse protéique locale incluent: la formation de mRNP stabilisateurs, régulateurs et transporteurs des ARNm, la stabilisation et le maintien du cytosquelette. Plus de poids serait donné à notre expérience avec les MEG-01 et aux comparaisons faites avec les neurones car des modèles entièrement différents et non reliés auraient confirmé que FMRP affecte bien le système en entier par sa fonction généralisée, mais toujours par les mêmes concepts de base. Ces travaux supporteraient des travaux additionnels visant à mieux comprendre les impacts d'une mutation dans le gène FMR1, qui n'affecterait donc pas seulement les neurones mais le corps en entier.