Le contenu protéique des MEG-01 change selon les besoins fonctionnels en lien avec le progrès de la différenciation

Les cellules progénitrices doivent toujours subir de grands changements d’expression génique afin de se différenciation en cellules matures aux fonctions et aux apparences spécialisées. Nous avons effectué une analyse par FACS afin de bien caractériser les modifications en contenu protéique que subit notre modèle au cours de la différenciation,

en s’intéressant particulièrement aux molécules semblant être dynamiques selon les analyses précédentes des complexes mRNP et de leur transport granulaire. Selon nos analyses, le contenu protéique demeure globalement inchangé entre les MEG-01 en prolifération et différenciés. Les molécules constitutives telles que FMRP, PABP, FXR2P et a-actinine donnent un degré de fluorescence par cellule stable, sans altération. Ces protéines semblent avoir un rôle tant dans les MEG-01 différenciées qu’en prolifération pour permettre les fonctions cellulaires vitales de base.

Typiquement, les marqueurs de différenciation sont exprimés dans les mégacaryoblastes et augmentent au cours de la maturation des MEG-01 pour atteindre des niveaux équivalents à ceux qui sont retrouvés dans les plaquettes relâchées en circulation dans le corps. Dans nos analyses par FACS, une augmentation peu significative de l’expression de ces marqueurs plaquettaires était observée pour les cellules différenciées. Notre hypothèse serait que notre lignée cellulaire non-induite serait déjà dans un état de différenciation élevé et exprimerait déjà des hauts niveaux de ces protéines. Pour objectiver une différence marquée, il faudrait idéalement utiliser les progéniteurs plus précoce, plus immature. Nos marqueurs ne permettraient donc que de démontrer que les MEG-01 sont effectivement destinés à devenir des cellules matures qui formeront nécessairement des PLP en fin de différenciation. À moins d’une détection plus sensible, ou d’une amplification des changements de fluorescence, ces marqueurs ne pourront pas servir pour quantifier le degré de différenciation de notre modèle.

À l'inverse, les signaux détectés par FACS pour les protéines ribosomales et la B-tubuline étaient remarquablement amplifiés dans les MEG-01 en différenciation. Si on se rappelle, Isakari et al. avaient aussi reporté l’augmentation d’expression de la B-tubuline dans ces conditions (Isakari et al., 2009). Il semblerait que les protéines qui voient leur contenu cellulaire total augmenté de façon marquée sont les protéines impliquées dans la traduction locale des ARNm et du transport microtubulaire. Donc, ces protéines qui sont impliquées dans la synthèse locale protéique et dans la formation de proplaquettes auraient besoin d'être plus fortement exprimées que les marqueurs plaquettaires ou les protéines de maintien basales afin de subvenir aux besoins des mécanismes de maturation cellulaire.

Nous pouvons ici faire un parallèle avec les neurones qui subissent une augmentation de la synthèse de protéines d’échafaudage ou de récepteurs de neurotransmission; des protéines requises pour permettre de former les réseaux synaptiques par la maturation des dendrites (Kindler & Kreienkamp, 2012).

En plus des analyses du contenu protéique total par FACS, nous avons également réalisé des immunobuvardages de type Western sur les extraits totaux de MEG-01 en prolifération et après différenciation. Les niveaux d’expression totale de chacune des protéines d'intérêt révélées ne changent pas de façon statistiquement significative durant le processus de différenciation. Toutefois, la précision et la performance analytique de ces approches quantitatives sont limitées. Curieusement, en jetant un coup d’œil de près aux immunobuvardages, des bandes supplémentaires chez les MEG-01 différenciés sont observées à la fois pour FMRP et la B-tubuline. Ces bandes pourraient correspondre soit à des isoformes distinctes enrichies dans les MEG-01 différenciés ou bien il s’agit de produits de dégradation spécifique, sachant que la différenciation est un processus apoptotique. Dans le cas de notre première hypothèse, des résultats dans ce sens ont déjà été observés par Khandjian et al. FXR1P (E. W. Khandjian et al., 1998). En effet, la différenciation de myoblastes en myotubes suite à l’activation de gènes spécifiques musculaires, génère la production de différentes isoformes de FXR1P, qui sont associées aux polyribosomes et transportés par l’intermédiaire du cytosquelette (E. W. Khandjian et al., 1998). Et donc, il est possible que la différenciation stimule aussi la synthèse d’isoformes spécifiques de FMRP présentant des poids moléculaires distincts des bandes classiques. De plus, Dury et al.ont étudié les différentes isoformes de FMRP dans les neurones et montré que certaines isoformes se comportent différemment. Les isoformes 1 et 7 se lient aux polyribosomes dans le cytoplasme, sont le plus fortement expriméeset ne se localisent jamais au noyau. Pour ce qui est des isoformes 6 et 12, elles se localisent au noyau de par leur domaine C-terminal contenant un signal de localisation aux corps Cajals nucléaires (Dury et al., 2013). C’est donc dire que les différentes isoformes de FMRP possèdent des fonctions variables selon leur distribution subcellulaire. Ainsi, il n’est pas surprenant que Xie et al. aient observé que les isoformes 12 et 15 de FMRP interagissent différemment avec les ARNm et qu’ils subissent différentes modifications post-

traductionnelles sujettes au changement selon le type de tissu et le stade développemental en question (Xie, Dolzhanskaya, LaFauci, Dobkin, & Denman, ). Par ces exemples, il est évident que différentes isoformes de FMRP peuvent potentiellement être exprimées à différents degrés d’intensité selon le type cellulaire et le niveau développemental, et que leurs fonctions varient entre-elles. Donc, il est possible que, lors de la différenciation des MEG-01, les cellules aient besoin d’enrichir certaines isoformes qui vont promouvoir la spécialisation, ce qui expliquerait l’apparition d’isoformes différentes (pour FMRP et B- tubuline dans notre cas) dans les analyses d’immunobuvardage. Pour vérifier la présence de différentes isoformes, il faudrait découper seulement les bandes alternatives sur le gel et analyser leurs séquences après digestion par spectrométrie de masse. Ceci permettrait d’identifier la séquence des acides aminés composant les protéines des bandes alternatives, pour voir si elles correspondent ou non aux séquences des isoformes connues dans la littérature. Néanmoins, l'apparition de ces bandes alternatives sur gel supporte l'hypothèse suggérée par les analyses de "steady-state" au FACS: le contenu protéique des cellules en différenciation est effectivement altéré durant ce processus complexe - et il ne serait d'ailleurs pas surprenant que FMRP et les complexes mRNPs soient à la base de cette régulation importante.

10.9. La différenciation des MEG-01 cause une diminution accrue de la synthèse