La différenciation des MEG-01 cause une diminution accrue de la synthèse protéique de-novo et des changements au niveau des produits finaux de

certaines protéines

Les essais FACS ont permis de comparer les niveaux totaux de protéines présentes par cellule, à un moment précis durant la différenciation des MEG-01, communément appelé dans le jargon anglais "steady-state". Cependant, pour mettre en évidence les taux de synthèse de-novo des protéines, des essais d’incorporation d'acides aminés radiomarqués au (35)S étaient nécessaires. Dans un premier temps, les cellules ont été cultivés dans un milieu sans acides aminés afin d’épuiser la réserve d’acides aminés libres. Puis, le milieu de culture sans sérum a été complémenté avec un mélange de méthionine et de cystéine radiomarqués pendant une heure afin que les cellules incorporent ces acides aminés dans les protéines nouvellement synthétisées. Les extraits totaux cellulaires ont été déposés sur

gel SDS-PAGE, révélés par exposition à un écran phosphore, et analysés au Typhoon. Ces analyses ont démontré que le taux de synthèse protéique totale des MEG-01 différenciés était visiblement plus faible que celles en prolifération. Cependant, si la synthèse protéique était effectuée en présence de sérum, les taux de synthèse dans la cellule augmentaient de beaucoup, amplifiant les différences observées entre les MEG-01 en prolifération et les MEG-01 différenciés. De plus, lorsque les MEG-01 se différencient, il semble y avoir une réduction du nombre de bandes protéiques différentes détectées. Ceci pourrait être expliqué soit par des altérations dans l'expression génique des cellules en différenciation, soit par la réduction de l'incorporation de la radioactivité totale sous les limites de détection dans les cellules différenciées résultant du faible taux de synthèse. Afin de mieux caractériser les différents types et les niveaux de protéines synthétisées avant et durant la différenciation, il faudrait séparer les extraits totaux sur gel 2D, colorer le gel, comparer les intensités de chaque point correspondant à une protéine d'intérêt potentiel et identifier les protéines par spectrométrie de masse pour chacun de ces points correspondant aux protéines qui seraient synthétisées considérablement plus ou moins fortement durant ce temps d'incubation. Cette information permettrait d'identifier les protéines dont l'expression est intensifiéee afin de subvenir aux besoins de la différenciation et dont les mRNPs favoriseraient la production.

Lors de certains essais d’incorporation au (35)S, nous avons effectué une lyse cellulaire suivie par des centrifugations différentielles pour séparer différents compartiments subcellulaires et ainsi déterminer la distribution des nouvelles protéines synthétisées. Les quatre fractions subcellulaires obtenues ont été déposées sur gel et après migration des protéines, ces dernières sont visualisées de la même façon que pour les extraits totaux, en maintenant la proportionnalité de chaque fraction et déposant le même équivalent de cellules pour chaque condition (proliférantes vs différenciées). De toute évidence, suivant la coloration au Coomassie, plus de protéines sont présentes dans la fraction des polyribosomes chez les MEG-01 que chez celles en différenciation. Lorsque les taux de synthèse protéique de-novo pour chaque fraction subcellulaire sont considérés, toutes les fractions provenant des MEG-01 différenciées contiennent moins de protéines nouvellement exprimés que celles des MEG-01 en prolifération – confirmant en un premier temps les observations pour les extraits totaux que la synthèse protéique totale est diminuée

dans les cellules en différenciation. En regardant les différentes fractions individuellement, la majorité des protéines de-novo des MEG-01 en prolifération se trouve dans la fraction soluble, suivie par la fraction du cytosquelette et aussi un peu dans la fraction polyribosomale (correspondant à la distribution de FMRP dans les MEG-01 en prolifération). Les MEG-01 en différenciation semblent avoir le même type de distribution de synthèse protéique de-novo; la majorité se retrouvant dans le surnageant, suivi de la fraction du cytosquelette – toutefois, aucune radioactivité est détectée dans la fraction polyribosomale (correspondant à l’absence de FMRP et des protéines ribosomales dans la fraction polyribosomale des MEG-01 différenciés). Une explication probable pour la présence de protéines nouvellement synthétisées dans la fraction polyribosomale des MEG- 01 en prolifération exclusivement serait que la synthèse protéique étant particulièrement active dans ces cellules, les protéines en cours de traduction lors de la préparation expérimentale des échantillons seraient restés associés aux polyribosomes et retrouvés conséquemment dans la fraction correspondante. Ceci signifierait donc que les protéines de-novo détectées dans cette fraction ne seraient pas nécessairement des protéines constitutives des polyribosomes, du cytosquelette, ou du noyau car elles peuvent tout simplement ne pas avoir eu le temps de se décrocher des ribosomes après leur traduction. Ainsi, nous constatons que la majorité des protéines synthétisées dans les MEG-01 tant en prolifération qu’en différenciation se retrouvent libres dans le surnageant, ou bien au niveau du noyau et du cytosquelette.

Ainsi, la distribution des protéines de-novo n'est pas altérée significativement par la différenciation des MEG-01, quoique les taux de synthèse et la combinaison de protéines exprimées dans les MEG-01 sont effectivement altérés. Le contenu des mRNPs en RBPs, incluant FMRP avec la machinerie traductionnelle et les adaptateurs aux moteurs moléculaires des microtubules semblant être si dynamiques durant la maturation des cellules, il est probable que cette dynamique soit derrière les altérations des taux de synthèse et de la régulation des ARNm exprimés au cours des différents changements morphologiques progressifs de la différenciation. Par ce même fait, l'interaction avec le cytosquelette et la régulation des mRNPs (par FMRP et d'autres RBPs) seraient donc

critiques au développement de l'ensemble des tissus corporels où la synthèse protéique locale est requise, tout comme elle l'est dans la synaptogenèse du cerveau.

11.

C

Mes travaux montrent que les MEG-01 constituent un excellent modèle de différenciation où se produit la réorganisation du cytosquelette, en plus de la synthèse protéique locale. Beaucoup de nos résultats montrent d’étonnantes similarités avec des travaux précédemment rapportés dans les neurones tout en apportant de nouvelles connaissanes sur les MEG-01. Étant donné le potentiel découvert chez ce modèle, nous pouvons s’en servir pour des études fonctionnelles beaucoup plus approfondies de FMRP et des autres RBP impliqués dans la différenciation, puisque le modèle est maintenant familier en que nous savons qu’il y a toujours un point de repère disponible pour fins de comparaison.