Le transport des acides aminés à travers la membrane plasmique de C. glutamicum nécessite soit des transporteurs spécifiques ou se fait tout simplement par diffusion (Figure 26). La lysine, la thréonine et les acides aminés branchés tels que la isoleucine, la L-valine et la L- leucine ont des transporteurs spécifiques au niveau de la membrane plasmique.
Le transport de la L-isoleucine à travers la membrane plasmique a été étudié chez C. glutamicum. L’isoleucine est excrétée soit par diffusion due à son hydrophobie, soit par un transporteur spécifique dépendant de la force protomotrice. Le transporteur de L-isoleucine est codé par deux gènes brnE et brnF et est activé ou réprimé selon la concentration intracellulaire de l’isoleucine. Lorsque celle-ci est supérieure à 7 mM, le transport de l’isoleucine est activé. Par ailleurs, ce transporteur est également celui de la L-valine et de la L-leucine (Hermann and Kramer, 1996; Kennerknecht et al., 2002; Zittrich and Kramer, 1994).
Le transporteur du L-glutamate n’a été identifié qu’en 2007 par Nakamura et al. et le mécanisme d’activitation de ce dernier lors d’un procédé de production du glutamate reste inconnu.
Figure 26 : Traversée de l’enveloppe de C. glutamicum par les acides aminés.Eggeling et Bott (2005) et Nakamura et al. (2007).
a) Système d’export des acides aminés
De nombreux facteurs clefs impliqués dans la régulation de chaque étape de la biosynthèse des acides aminés ont été très étudiés. Ce n’est pas le cas des exporteurs des acides aminés qui eux, ont fait l’objet de peu d’études. Ainsi il était autrefois supposé que l’excrétion du glutamate se faisait par diffusion simple à travers la membrane plasmique (Mori and Shiio, 1983; Takinami et al., 1965).
a.1) Excrétion de L-lysine
Le gène codant le transporteur spécifique de la lysine lysE a été mis en évidence par complémentation d’un mutant de C. glutamicum dépourvu de l’exporteur (Vrljic et al., 1995).
Le transporteur LysE est un polypeptide de 233 acides aminés. La transcription du gène lysE est contrôlée par le régulateur LysG. Chez C. glutamicum, le régulateur LysG appartient à une grande famille de régulateur dite LysR-type transcriptional regulators (LTTR). C. glutamicum possède 10 régulateurs appartenant à cette famille (Henikoff et al., 1988). Des études ont montré que in vivo le régulateur LysG interagit avec une région intergénique lysE-lysG et que in vitro le régulateur LysG interagit avec le promoteur de LysE (Bellmann, 2000). Le co-inducteur de la transcription du gène lysE est la L-lysine (concentration intracellulaire comprise entre 35 et 42 mM) ou la L-arginine. Ces deux acides aminés sont exportés par LysE avec une vitesse similaire de 0,75 nmol.min-1mg-1. D’autres acides aminés basiques tels que la L-arginine, la L-citrulline et la L-histidine sont reconnues par le régulateur LysG pour activer la transcription du gène lysE. Cependant, la L-citrulline et la L-histidine ne sont pas exportées par le transporteur LysE. Le rôle physiologique du système LysE-LysG est d’empêcher une bactériostase due à des concentrations élevées en L-lysine ou en L-arginine. En effet, comme l’arginine, la lysine est un acide aminé qui n’est pas dégradé après sa synthèse. C. glutamicum possède d’autres exporteurs capables d’exporter la L-histidine, la L-citrulline et la L-ornithine (Bellmann et al., 2001).
a.2) Excrétion de L-thréonine
Le gène thrE codant l’exporteur de la L-thréonine est exprimé lorsque les conditions de culture sont favorables et en présence de peptides riches en thréonine. Lorsque le gène thrE est surexprimé, la L-thréonine est exportée avec une vitesse de 3,8 nmol.min-1mg-1, alors
L-sérine est également un substrat de ThrE. L’efflux de L-thréonine débute dès lors que sa concentration intracellulaire atteint 170 mM. A cette concentration, trois composants indépendants contribuent à l’export de la L-thréonine. L’excrétion de la L-thréonine par le système d’export représente 59 %, alors que 22 % sont excrétés par diffusion simple et les 19% restant empruntent une voie à ce jour inconnue (Simic et al., 2001). L’activité d’export de la L-thréonine dépend de la force protomotrice (Palmieri et al., 1996). Il a été rapporté dans la littérature que C. glutamicum est incapable de tolérer une concentration intracellulaire élevée en L-thréonine et que l’export de cet acide aminé est limité (Archer et al., 1991; Ishida et al., 1994). Des différences entre le système d’export de la thréonine et celui de la L-lysine existent. Le système LysE-LysG contrôle la concentration intracellulaire de la L-L-lysine ou de la L-arginine par l’export, tandis qu’une concentration importante de L-thréonine et la présence du transporteur ThrE ne permettent pas d’augmenter l’activité du transporteur. Néanmoins la surexpression du transporteur ThrE permet une augmentation de 40% de l’accumulation de L-thréonine dans le milieu extérieur (Simic et al., 2002). L’étape d’excrétion reste l’étape limitante dans le processus de production de L-thréonine.
a.3) Excrétion du glutamate chez C. glutamicum
Le glutamate est un acide aminé dicarboxylique (Figure 27), hydrophile chargé. Il est incapable de diffuser librement la membrane plasmique. En limitation en biotine, le L-glutamate est exporté massivement à une vitesse de 20 nmol.min-1.mg-1. Des études ont montré que l’étape d’excrétion était l’étape limitante lors du procédé thermo-induit de production de glutamate (Lapujade, 2000; Lapujade et al., 1999). Nampoothiri et son équipe (Nampoothiri et al., 2002) ont pu déclencher une production de glutamate en mutant la voie de biosynthèse des phospholipides, mais ces mutants requièrent encore un stress pour l’induction de l’excrétion du glutamate.
Figure 27 :Glutamate ou acide glutamique. pKa=2,2; pKb=9,7 pKr= 4,3 et pHi= 3,2.
La perméabilité de la membrane de C. glutamicum est inchangée en limitation de biotine. En consequence les acides aminés, autres que le glutamate, l’acétate et les ions tels que K+, H+ et Cl-, ne sortent pas de la cellule lors de ce procédé de production de glutamate (Gutmann et al., 1992; Hoischen and Kramer, 1990; Krämer, 1994). Malgré des études approfondies concernant les procédés de production du glutamate depuis 1957, aucun système d’export de glutamate n’a été caractérisé avant 2007. A cette date, le gène NCgl 1221, codant un exporteur du glutamate chez C. glutamicum ATCC 13869 a été identifié. Lorsque le gène NCgl 1221 est délété, il y a absence d’excrétion du glutamate alors que la surexpression de celui-ci permet une augmentation de la production du glutamate, mais uniquement suite à une induction. Ces résultats suggèrent qu’une modification de l’environnement de l’exporteur glutamate est nécessaire pour permettre l’activation de celui-ci. Il a été proposé que l’induction altère la membrane plasmique et entraine une transformation structurale de la protéine NCgl1221, ce changement structural permettant l’export de l’acide glutamique (Nakamura et al., 2007).
b) Systèmes d’import du glutamate
D’autres systèmes d’import et d’export des acides aminés ont déjà été identifiés dans la membrane plasmique chez C. glutamicum (Eggeling and sahm, 2001). Les systèmes d’import tels que Glu ABCD, Lys I, BrnQ, AroP, sont impliqués dans le transport de certains acides aminés comme le L-glutamate, la L-lysine, la L-Isoleucine, et les acides aminés aromatiques chez C. glutamicum (Eggeling and Sahm, 2003; Seep-Feldhaus et al., 1991;
premier système, Glu ABCD, grâce auquel l’entrée du glutamate se fait avec une forte affinité (Km 0,5 à 1,3 µM) et à une vitesse Vmax de 15 nmol.min-1mg-1, est sous le contrôle de la répression catabolique par le glucose ou le saccharose (Kronemeyer et al., 1995). Des auteurs rapportent que l’expression des gènes gluABCD est fortement régulée par la source en azote (Burkovski, 2003). En présence de fortes concentrations en ammonium, la croissance de C. glutamicum est inhibée quand le L-glutamate est utilisé comme source de carbone (Shiio et al., 1982). Le second transporteur a une affinité modérée pour le L-glutamate (Km de 0,6 mM) et une vitesse d’import de 15 nmol.min-1 mg-1. Ce transport est controlé par le potentiel membranaire et est dépendant des ions sodium (Burkovski et al., 1996).
L’idée que le système d’import du glutamate pouvait jouer simultanément le rôle d’exporteur a vite été écartée, puisque chez un mutant délété pour le système d’import du glutamate l’activité d’export du glutamate n’est pas altérée (Kronemeyer et al., 1995).