Afin de déterminer le rôle des acides mycoliques dans les modifications intracellulaires au cours de la fermentation glutamique chez C. glutamicum 2262, les activités enzymatiques ODH et PDH, la régulation de l’activité ODH (état de phosphorylation d’OdhI)
et l’expression des protéines de stress ont été comparées entre C. glutamicum 2262, C. glutamicum 2262 NP et C. glutamicum 2262 ∆pks13. L’absence d’acide mycolique chez ce
dernier a un effet sur la croissance, la consommation du glucose et la production du glutamate. En effet, du point de vue cinétique, peu de glucose est consommé par rapport à la souche de référence, la vitesse spécifique de croissance maximale n’est que de 0,1 h-1 et aucune excrétion du glutamate n’est observée. Des modifications intracellulaires ont également été observées, les activités enzymatiques sont maintenues et aucun stress thermique ne semble être ressenti par le mutant C. glutamicum 2262 ∆pks13. Les résultats des chapitres précédents ont montré que C. glutamicum 2262 produit du glutamate uniquement lorsque ressent le stress thermique est ressenti et que les deux activités enzymatiques l’ODH et la PDH sont diminuées. Ces deux conditions ne sont pas établies chez le mutant, ce qui semble avoir pour conséquence l’incapacité à déclencher l’excrétion du glutamate. L’ensemble de ces résultats chez le mutant C. glutamicum 2262 ∆pks13 suggère le rôle prépondérant de la bicouche d’acide mycolique ou d’un de ses composants pour induire la cascade d’événements permettant l’excrétion du glutamate.
Par ailleurs, nous avons également observé qu’une modulation de la composition en acides mycoliques de la souche C. glutamicum 2262 et du variant non producteur du glutamate se produisait au cours d’une culture avec élévation de la température de 33 à 39°C. Nous avons observé une différence entre les deux souches avant induction, le rapport acides mycoliques saturés/insaturés dans les lipides extractiblesest 4 fois supérieur chez la souche de référence. Cette différence était encore plus importante 3 heures après induction. Ces observations peuvent s’expliquer par un remaniement de la membrane mycolique plus
de composition de la mycomembrane au cours d’un procédé thermo-induit de production du glutamate chez C. glutamicum. Par mesure de l’anisotropie de fluorescence, la fluidité globale de celle-ci a été suivie aussi bien chez la souche de référence que chez le variant non producteur. Chez C. glutamicum 2262, 1 heure après le passage de 33 à 39°C, la fluidité était augmentée, son niveau maximal étant atteint alors que la vitesse spécifique de production atteignait sa valeur maximale (Bokas et al., 2007). Ces mêmes auteurs rapportent que la fluidité est maintenue constante au cours du procédé de production du glutamate chez C. glutamicum 2262 NP. L’élévation de température aurait donc un effet sur le métabolisme lipidique et induirait des modifications de la composition en acides corynomycoliques à l’origine d’un changement de la fluidité de la bicouche lipidique externe, en parfaite corrélation avec la capacité du micro-organisme à excréter du glutamate (Bokas et al., 2007). L’augmentation de la fluidité de l’enveloppe nécessite une augmentation des proportions en acides gras et mycoliques insaturés chez C. glutamicum 2262. Or, l’analyse de la composition lipidique de l’enveloppe de cette souche (tableau 7) rapporte plutôt une augmentation des rapports saturés/insaturés aussi bien des acides gras que des acides mycoliques. De ce fait, les analyses physiques (mesure de la fluidité) et les analyses biochimiques (analyse de la composition lipidique) de C. glutamicum 2262 semblent contradictoires. Les données de la littérature concernant d’autres micro-organismes rapportent plutôt l’augmentation de ces rapports lors de l’élévation de la température afin de s’adapter à ce changement environnemental. Par ailleurs, la modulation de l’enveloppe au cours d’un procédé thermique a également été étudiée chez C. glutamicum RES 167. Dans cette étude, le gène NCgl2775 présent dans un cluster de gènes avec les gènes pks13, accd4 et fadD32, impliqués dans la dernière étape de condensation des acides mycoliques a été identifié. NCgl2775 est transcrit uniquement lors d’un stress thermique. La protéine NCgl2775 serait impliquée dans le processus de réorganisation de la bicouche mycolique suite à l’augmentation de la température (Meniche et al., 2009). De façon similaire, C. glutamicum 2262 semble entreprendre des changements pour remanier sa couche mycolique directement en contact avec le milieu extérieur afin de se protéger des dommages dus à cette élévation de température. Par ailleurs, les travaux de Hashimoto et al (2006) rapportent un changement de la composition des acides mycoliques et de leur contenu suite à differents traitements aboutissant à l’excrétion du glutamate chez C. glutamicum ATCC 13869. Enfin, le contenu en acide mycolique est diminué suite à l’ajout de l’éthambutol chez C. glutamicum ATCC 13032
La comparaison cinétique et métabolique des deux souches, C. glutamicum 2262 et 2262 ∆pks13, nous a permis de supposer que la bicouche mycolique est essentielle au déclenchement de la cascade aboutissant à l’excrétion du glutamate. Cependant, la présence de la bicouche chez C. glutamicum 2262 NP n’en fait pas une souche productrice du glutamate. Il est possible qu’au sein de cette bicouche mycolique soient présents des éléments clés responsables du ressenti du stress thermique et par la suite, à l’origine des modifications intracellulaires chez C. glutamicum 2262. Ces éléments clés restent à caractériser.
La bicouche mycolique renferme des protéines dont des porines. Ces porines constituent des canaux ioniques hydrophiles traversant la mycomembrane des Corynebacteriaceae. Elles ont été isolées chez C. glutamicum en 1995 (Niederweis et al., 1995). Les auteurs de ces travaux décrivent quatre porines (PorA, PorB, PorC et PorH). Deux porines sont spécifiques des cations (PorA et PorH) et deux sont spécifiques des anions (PorB et PorC). Elles semblent être des candidats potentiels pour la traversée des molécules chargées et donc potentiellement le glutamate à travers la bicouche mycolique. Dans la suite de ce travail, nous nous sommes donc intéressés à l’expression des porines PorB et PorC qui pourraient être responsables du passage du glutamate à travers la mycomembrane.
Chapitre IV : Caractérisation des porines localisées dans la mycomembrane de