A. Construction du mutant C. glutamicum 2262 pknG::kan

Le mutant C. glutamicum 2262 pknG::kan dépourvu de la protéine kinase PknG est construit par insertion du gène de résistance à la kanamycine dans le gène pknG. Les deux amorces pknG_am et pknG_av (voir tableau 12) ont été utilisées pour amplifier un fragment d’ADN de 0,8 kb par PCR issu du gène pknG. Comme le génome de C. glutamicum 2262

glutamicum ATCC 13032 (Genbank BX927147). Le produit PCR est cloné dans le vecteur Zéro-Blunt (Invitrogen), ce plasmide contient une cassette codant la résistance à la kanamycine. Le plasmide Zéro-Blunt contenant le gène d’intérêt est incorporé chez C. glutamicum 2262 par électroporation. Les transformants ayant intégré le plasmide sont sélectionnés sur milieu BHI contenant 50 µg. ml^-1 de kanamycine et incubés à 33°C.

Tableau 10 : Séquences des amorces utilisées pour l’amplification d’un fragment de 0,8 kb du gène pknG

Amorces Séquences

pknG_am CGA-ATT-CCT-CGC-CGA-CAT-CAC-CAC

pknG_av AGA-ATT-CGC-ATA-GGA-GGA-TCC-GGA-GAG-CAT-A

II.A.1. Amplification du gène codant la protéine kinase PknG par PCR

L’amplification in vitro de fragment d’ADN de 0,8 kb par PCR, est effectuée à l’aide d’une enzyme polymérase haute fidélité (PFX) et d’un thermo-cycleur Applied Biosystems (PCR SYSTEM 2700).

Le mélange réactionnel contient (100 µl): ADN matrice 5 ng, (2µl de l’ADN dilué au 20^ème)

Amorces (pknG_am et pknG_av) 100 pmol pour chaque amorce (1µl) dNTP, 2,5mM (10µl)

Tampon réactionnel 10X (10µl) MgSO4 50 mM (2µl)

Polymérase PFX 2,5 unités (1µl) Eau ultrapure stérile (75 µl)

L’étape de dénaturation de 5 minutes à 94°C est suivie de 30 cycles d’amplification composés par 1 minute de dénaturation à 94°C, 1 minute d’hybridation à 53°C, et 2 minutes d’élongation à 72 °C. Enfin une étape d’élongation terminale de 7 minutes à 72°C est appliquée à l’échantillon.

II.A.2. Vérification du produit PCR par électrophorèse en gel d’agarose

Les fragments d’ADN amplifiés ont été déposés en présence du tampon de charge (Annexe II) sur un gel d’agarose 1% (1g d’agarose dans 100 ml de tampon Tris/Borate/EDTA (TBE) (0,5X)) (Annexe II). Le produit PCR est révélé à l’aide de Syber Safe (10.000X concentré dans du DMSO). Après migration du gel d’électrophorèse dans un tampon TBE (0.5 X) à une

tension comprise entre 80 et 100V, la bande qui correspond à un poids moléculaire de 0,8 kb est découpée du gel, et stockée à -20°C jusqu’à l’extraction du produit PCR.

II.A.3 Extraction de l’ADN amplifié du gel d’agarose

Afin de purifier l’ADN amplifié, une étape d’extraction de l’ADN du gel d’agarose est donc nécessaire. L’extraction d’ADN est effectuée avec le kit NucleoSpin Extract II (PCR clean-up gel extraction) suivant les instructions du fournisseur Macherey-Nagel. Le produit PCR purifié du gel est déposé sur gel d’agarose 1% + Syber Safe afin de vérifier sa pureté.

• Ligation du Produit PCR

Le plasmide utilisé pour la ligation est le plasmideZéro Blunt PCR(Invitrogen), il a une taille de 3,5 kb et contient la cassette de résistance à la kanamycine.

Le mélange réactionnel (10 µl) contient:

Plasmide zéro Blunt PCR à 10ng/µl, 0,5 µl Tampon de ligation à (5X) 2,0 µl Produit PCR purifié 7,5 µl Ligase à (100U/ µl) (ajouté au dernier moment) 0,3µl.

Le mélange est bien homogénéisé et laissé à température ambiante jusqu’à son utilisation. • Préparation des cellules compétentes

E. coli DH5 α

Un microlitre du stock glycérol de E. coli DH5α (Tableau 13) a été étalé sur une boîte de Pétri contenant du milieu LB+Agar (20 g.l^-1 de LB et 20 g.l^-1 agar). La boîte de Pétri est incubée toute une nuit à 37°C. Une colonie sur boite est remise en culture dans du milieu LB à 37°C et sous agitation pendant une nuit. Puis, une seconde culture en milieu LB est ensemencée à partir de la culture de nuit. Lorsque les cellules sont en phase exponentielle de croissance (DO₆₀₀ = 0,7), elles sont bloquées immédiatement dans un mélange glace, H₂O et NaCl. Les cellules sont par la suite centrifugées pendant 7 minutes à 9000 rmp (Avanti ^TM 30 Centrifuge, Beckman) à 0°C puis lavées deux fois par de l’eau milliQ glycérolée (10%) stérile à 4°C. Après la dernière centrifugation, le surnageant est éliminé en partie, seules quelques dizaines de microlitre du surnageant sont gardées afin de resuspendre les cellules. Enfin les cellules rendues ainsi compétentes à la transformation sont conservées à -80°C en aliquots de 50µl.

Tableau 11 : Présentation des souches bactériennes utilisées lors des clonages

Description des souches

E. coli DH5α F^- φ80dlacZ M15 (lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk^-, mk⁺) phoAsupE44 λ^-thi-1 gyrA96 relA1

E.coli DH5αMCR F^- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ M15 (lacZYA-argF)U169

deoRrecA1 endA1 hsdR17(rk^-, mk⁺) phoAsupE44 λ^-thi-1 gyrA96 relA1

C. glutamicum 2262

Les bactéries sont cultivées dans du milieu MCGC+ 3,4% glucose jusqu’au début de la phase exponentielle de croissance (Biomasse = 1,5 g.l^-1). La culture est stoppée dans un bain froid (la température < - 5°C). Les cellules sont rapidement centrifugées à 5000 rpm (Avanti

TM

30 Centrifuge, Beckman) pendant 15 minutes et à 4°C. Le culot est lavé deux fois par de l’eau milliQ glycérolée (10%) stérile à 4°C, afin d’éliminer les sels et de fragiliser les enveloppes cellulaires. Après la dernière centrifugation, le surnageant est éliminé en partie, quelques dizaines de microlitre du surnageant sont gardées afin de resuspendre les cellules. Enfin les cellules rendues ainsi compétentes à la transformation sont conservées à -80°C en aliquots de 50µl.

• Transformation des bactéries par électroporation E. coli

Le choc électrique est effectué à l’aide d’un électroporateur Gene Pulser de Biorad réglé à 2500 V, 25 µF et 200 sur un mélange préalablement incubé 5 minutes dans la glace, contenant 50 µl de cellules compétentes de E. coli DH5α et 2µl de produit de ligation dans une cuvette de 2 mm. Après le choc électrique, le mélange cellule/ADN est alors repris rapidement dans 500 µl de milieu riche LB et mis en culture pendant 45 minutes à 37°C.

C. glutamicum 2262

Cette technique, décrite à l’origine pour E. coli, a été adaptée pour la transformation des Corynébactéries (Bonamy et al., 1990).

Pour C. glutamicum 2262, le choc électrique est effectué à 1800 V, 25 µF et 400 . Contrairement à la transformation avec E. coli DH5α, C. glutamicum est repris dans du milieu riche BHI après transformatrion. Les cellules sont ensuite incubées pendant 45 min à 30°C. Elles sont finalement concentrées par centrifugation.

Les cellules concentrées sont étalées sur boite soit contenant du milieu BHI et 50 µg.ml de Kanamycine pour C. glutamicum 2262 soit contenant du milieu LB et 50 µg.ml^-1 Kanamycine pour E. coli DH5α. Les boites sont incubées à 30 et 37°C pour C .glutamicum et E .coli DH5α

respectivement pendant 24 heures. Les colonies sur boites correspondent à E. coli DH5α

contenant le plasmide avec l’insert d’intérêt et le mutant C. glutamicum 2262 pknG::kan. • Extraction et purification du plasmide et vérification de l’insert par digestion chez E. coli DH5α

L’extraction du plasmide est effectuée selon le kit d’extraction plasmidique NucleoSpin plasmid et suivant les instructions du fournisseur Macherey-Nagel.

La purification du plasmide est effectuée selon le kit High-copy plasmid purification plasmidique (AX 100) et dont le fournisseur est Macherey-Nagel. L’isopropanol est rajouté à la suspension purifiée, puis celle-ci est stockée 30 minutes à -80°C. La suspension est par la suite centrifugée pendant 30 minutes à 14500 rpm (Avanti ^TM 30 Centrifuge, Beckman) à 4°C. Après centrifugation, le surnageant et éliminé le culot est relavé trois fois avec de l’éthanol 80% stérile froid (-20°C). Après la dernière centrifugation à 14500 rpm (Avanti ^TM 30 Centrifuge, Beckman) pendant 13 min à 4°C, le culot est repris dans 10 µl d’eau ultra-pure et laissé pendant 1h30 à température ambiante. Un gel d’agarose est réalisé afin de vérifier si le plasmide migre bien à la taille attendue.