II.6.1 Matériel végétal
Les fruits de six génotypes [quatre variétés d’oranges (C. sinensis), le citron Eureka (C.
limon) et le pamplemousse Deep Red (C. maxima)] ont été récoltés à trois stades de
développement au cours de la période 2005-2006. Les trois stades de développement sont décrits dans le Tableau 7.
Tableau 7. Stades de développement des fruits récoltés.
Diamètre moyen (cm)±ETa
Génotype Août Novembre Février
Orange Shamouti 4,7±0,2 7,0±0,3 7,2±0,6
Orange Sanguinelli 4,9±0,4 5,4±0,1 6,2±0,1
Orange Cara Cara 5,7±0,2 8,4±0,5 8,6±0,4
Orange Huang pi Chen 5,1±0,2 7,2±0,4 8,3±0,3
Citron Eureka 3,4±0,1 4,8±0,1 5,4±0,2
Pamplemousse Deep Red 11,6±0,2 12,3±0,4 12,6±0,3
amoyenne pour 15 fruits ± ET, écart type.
La pulpe des fruits a été immédiatement congelée dans l’azote liquide et conservée à – 80°C. Les ARN totaux ont été extraits des sacs à jus des fruits d’après une méthode dérivée de celle décrite par MANNING (1991). Brièvement, une lyse des cellules est réalisée par le broyage dans l’azote liquide de la pulpe des fruits et le mélange d’un volume de poudre obtenue dans deux volumes de tampon d’extraction [Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM, NaCl 100 mM, SDS 1% (v/v)] et un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1, v/v) à pH 7. L’utilisation de phénol saturé en eau permet la séparation des acides nucléiques et des protéines qui présentent des solubilités différentes dans les solvants polaires. Le
Matériels et Méthodes
75 mélange précédent est centrifugé 10 minutes à 5000 rpm à 4°C ; les ARN sont présents dans la phase aqueuse tandis que les protéines précipitent à l’interface solvant/eau. Ainsi, le surnageant est placé dans un nouveau tube contenant un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1, v/v). Le mélange est centrifugé 10 minutes à 5000 rpm à 4°C et le surnageant est prélevé et placé dans un nouveau tube. Les polysaccharides sont éliminés par ajout de 0,2 volume d’acétate de sodium 3 M, 0,25 volume d’éthanol absolu et 1 volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1, v/v) et par centrifugation 10 minutes à 5000 rpm à 4°C. Le surnageant est une nouvelle fois lavé par l’ajout d’un volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1, v/v) et par centrifugation 10 minutes à 5000 rpm à 4°C. Puis, les ARN présents dans la phase aqueuse sont précipités par ajout d’un volume de chlorure de lithium 4 M et incubation une nuit à 4°C. Après centrifugation d’une heure à 14 000 rpm à 4°C, le culot est lavé à l’éthanol 70% (v/v) puis repris dans 1,5 mL d’eau traitée au DEPC (diéthylpyrocarbonate). Un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1, v/v) est ajouté et le mélange est centrifugé 10 minutes à 14 000 rpm à 4°C. Le surnageant est placé dans un nouveau tube contenant un volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1, v/v) et le mélange est centrifugé 10 minutes à 14 000 rpm à 4°C. Après récupération du surnageant, les ARN sont précipités par ajout de 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M et 2 volumes d’éthanol absolu. Après incubation d’une heure à – 20°C, la solution est centrifugée 15 minutes à 14 000 rpm à 4°C. Le culot est lavé avec une solution d’éthanol 70 % (v/v), séché puis repris dans 100 µ l d’eau DEPC. Les ARN extraits sont conservés à – 80°C. Les ARN sont ensuite purifiés par l’utilisation d’une DNase I du kit RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) selon la méthode recommandée par le fabricant. La qualité des ARN a été vérifiée par migration sur gel d’agarose 1,2 % (p/v) suivie d’une visualisation sous lumière UV d’après le protocole de SAMBROOK et al. (1989).
II.6.2. Définition des amorces
Les amorces utilisées pour l’amplification spécifique des ADNc des gènes Dxs, Psy, Pds,
Zds, Lcy-b, Hy-b et Zep sont présentées dans le Tableau 3, 3ème article, partie III.3.1. Ces amorces ont été définies à partir des alignements des séquences codantes de ces gènes qui ont été isolées à partir des fruits d’agrumes et qui sont disponibles dans les bases de données. Le logiciel BioEdit version 7.0.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), programme clustalW alignement multiple, a été utilisé pour l’alignement des séquences et le logiciel Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm) pour la définition des amorces avec les conditions suivantes :
- taille des amorces minimum 19, optimum 20, maximum 21 ; - Tm minimum 59, optimum 60, maximum 61 ;
- pourcentage de GC minimum 45%, optimum 50%, maximum 55% ; - pas plus de 3 G consécutifs ;
- les 5 derniers nucléotides ne doivent pas comporter plus de 2 G ou C consécutifs.
II.6.3. Quantification des ARN totaux
Les ARN totaux ont été quantifiés par fluorimétrie avec l’utilisation du RiboGreen (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Seul le complexe ARN-RiboGreen émet de la fluorescence (émission maximum à 520 nm). Ainsi, le dosage n’est pas faussé par la présence de protéines ou de nucléotides libres provenant d’ARN ou ADN dégradés. Cette méthode permet de mesurer des concentrations d’ARN comprises entre 1 ng.mL-1 et 1µ g.mL-1.
II.6.4. Réaction de PCR en temps réel
Un appareil LightCycler 2.0 (Roche) muni du logiciel LightCycler 4.0 ® a été utilisé. La réaction est réalisée à partir de 50 ng d’ARN totaux dans un volume de 10 µ L contenant 2,5 unités Multiscribe Reverse Transcriptase (Applied Biosystems), 1 unité RNase Inhibitor (Applied Biosystems), 2 µ L LC FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche) et 2,5 µ M de chaque amorce. La reverse transcription (RT) est réalisée à 48°C 30 minutes. Après une dénaturation à 95°C pendant 10 minutes, les séquences d’ADNc sont amplifiées d’après le programme détaillé dans le Tableau 8.
Tableau 8. Etapes du programme de PCR en temps réel.
Température Durée Nombre de
cycles RT 48°C 30 min 1 Dénaturation 95°C 10 min 1 Dénaturation 95°C 2 s Appariement 60°C 10 s Elongation 72°C 15 s 45 95°C 15 s 42°C 1 min Fusion 95°C 0 s 1 Refroidissement 40°C 20 s 1
Matériels et Méthodes
77 L’intensité de la fluorescence émise par le SyBr Green, intercalant de l’ADN double brin, est enregistrée durant la phase d’élongation à 72°C. La spécificité de l’amplification est illustrée par la courbe de fusion de l’amplicon d’un gène d’intérêt. Cette courbe est formée à partir de la décroissance de la fluorescence du SyBr Green au fur et à mesure de son décrochage de l’ADN lors de la montée en température. Au point de fusion, les deux brins d’ADN sont séparés et la fluorescence diminue rapidement. La courbe de fusion d’un amplicon dépend de sa composition en nucléotides et de sa longueur. Tous les produits PCR amplifiés avec le même couple d’amorces doivent avoir la même température de fusion. Ainsi, si l’amplification est spécifique, un seul pic apparaît sur la courbe de fusion. Des pics supplémentaires peuvent être présents si la réaction n’est pas spécifique ou dans le cas de la formation de dimères d’amorces puisque le SyBr Green se lie à tout ADN double brin d’où l’importance de la définition des amorces.
II.6.5. Quantification relative des ARNm
L’appareil LightCycler permet d’analyser l’augmentation de la fluorescence (liée à l’augmentation de la quantité d’ADN) lors de la phase exponentielle de la PCR c'est-à-dire lorsqu’il y a une relation linéaire entre le log de la quantité d’ADN et le nombre de cycles. Le logiciel mesure le nombre de cycles nécessaires pour atteindre un niveau de fluorescence fixé ou seuil. L’intersection entre ce seuil et la courbe de la réaction PCR (fluorescence en fonction du nombre de cycles) est appelée crossing point (cp). Plus les concentrations initiales en ARN ou ADN sont faibles et plus la valeur cp sera grande. La Figure 18 illustre la relation entre cp et le log de la concentration en ADN.
Figure 18. Détermination des crossing points (a) et relation entre cp et log de la concentration en ADN (b).
Nous avons quantifié les ARNm par l’obtention d’une courbe de calibration. Un échantillon de même nature que les échantillons à analyser (ARN totaux extraits de la pulpe des fruits) de concentration connue est utilisé pour obtenir cette courbe de calibration en réalisant 10 points de dilution de cet échantillon et en utilisant les mêmes amorces et mêmes conditions PCR que pour les échantillons à analyser. Un exemple de courbe de calibration obtenu pour le gène Hy-b (valeurs cp en fonction du log de la concentration en ARN) est présenté dans la Figure 19.
Seuil Cp Nombre de cycles N o m b re d e c y c le s Seuil Cp Nombre de cycles N o m b re d e c y c le s
Matériels et Méthodes
79 Figure 19. Courbe de calibration pour le gène Hy-b obtenue à partir d’une série de
dilutions d’un standard.
Les valeurs cp des échantillons à analyser sont déterminées en fonction de cette courbe de calibration ainsi que les quantités relatives d’ARNm dans les échantillons analysés. Ces valeurs sont ensuite divisées par la quantité initiale d’ARN totaux dans les échantillons mesurée précisément avec du RiboGreen d’après la méthode décrite par ALOS et al. (2006) ce qui permet d’obtenir une bonne répétabilité des analyses. Chaque échantillon a été analysé au moins trois fois.