CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Structuration de la diversité phénotypique

Les agrumes ont des compositions complexes en caroténoïdes. Notre premier objectif était de déterminer la diversité des compositions en caroténoïdes au sein du genre Citrus et d’évaluer l’importance du facteur génétique. Nous avons analysé la diversité des compositions en caroténoïdes dans les jus de fruits au sein du genre Citrus en étudiant 25 génotypes, cultivés sur un même site, soumis au mêmes pratiques culturales et représentant les 8 espèces cultivées d’agrumes. Nous avons mis en évidence la richesse des petits agrumes (mandarines et clémentine) produits en région méditerranéenne en β-cryptoxanthine (valeurs comprises entre 9,09 ± 0,55 et 17,51 ± 0,90 mg.L^-1), composé responsable de la coloration orange vif et ayant plusieurs fonctions biologiques, provitamine A et antioxydant. Par ailleurs, nous avons mis en évidence l’importance du facteur génétique en montrant la contribution de la variabilité génétique à la variance pour chaque composé ce qui permet d’analyser plus en détail les déterminants génétiques des compositions en caroténoïdes chez les agrumes. De plus, sur la base des compositions en caroténoïdes, nous avons montré que les 25 génotypes sont répartis en trois groupes qui correspondent aux trois taxons de base (C. reticulata, C.

medica et C. maxima) et que cette classification est en accord avec les organisations

précédemment établies avec des marqueurs moléculaires neutres. Ainsi nous avons suggéré que l’évolution des agrumes est le principal facteur d’organisation de la diversité des compositions en caroténoïdes des fruits. L’étude de l’organisation de la diversité des compositions en caroténoïdes au sein du genre Citrus nous a également permis de proposer quelles sont les étapes de la voie de biosynthèse qui semblent impliquées dans la différenciation des phénotypes caractéristiques des trois groupes précédemment distingués. Les mécanismes de régulations de la voie de biosynthèse ont ensuite été étudiés prioritairement à ces étapes catalysées par PSY, LCY-b, LCY-e, HY-b et ZEP.

Diversité allélique des gènes de la chaîne de biosynthèse

Notre deuxième objectif était d’étudier les bases moléculaires à l’origine de la diversité des compositions en caroténoïdes précédemment établies en analysant le polymorphisme des gènes de la chaîne de biosynthèse entre les différentes espèces de Citrus. Nous avons étudié le polymorphisme des fragments d’ADN porteurs des gènes de biosynthèse entre les 25 génotypes précédemment caractérisés phénotypiquement par des analyses RFLP et SSR. Le nombre de copies des gènes Psy, Pds, Zds, Lcy-b, Lcy-e, Hy-b et Zep a été déterminé dans le génome des espèces du genre Citrus et nous avons pu étudier les liens entre diversité phylogénétique de ces gènes et diversité phénotypique. Le phénotype des pamplemousses et

Conclusion et Perspectives

171 pomelos, avec une limitation de la chaîne de biosynthèse des caroténoïdes à l’étape catalysée par LCY-b, pourrait être lié à une variabilité allélique du gène Lcy-b. Le phénotype des mandarines, oranges et clémentine, espèces produisant des β,ε-xanthophylles à côté des β,β-xanthophylles semble être dû à la variabilité allélique du gène Lcy-e. Cependant, pour les autres étapes clés catalysées par PSY, HY-b et ZEP, le polymorphisme révélé par les analyses RFLP et SSR dans les séquences des gènes codant pour ces enzymes, n’a pas permis d’expliquer le phénotype des agrumes acides ainsi que l’accumulation massive des β,β-xanthophylles (β-cryptoxanthine et violaxanthine) pour les génotypes du groupe des mandarines.

L’étude de la variabilité de la séquence codante du gène Lcy-b par DHPLC a confirmé la différenciation interspécifique suggérée par les marqueurs RFLP et SSR. De même, le polymorphisme mis en évidence dans ou autour des séquences des autres gènes de biosynthèse (Psy, Pds, Zds, Lcy-e, Hy-b et Zep) doit être confirmé sur un échantillon variétal plus large et par des méthodes permettant de détecter des variations dans les séquences codantes. Dans un premier temps, des analyses permettant de mettre en évidence du polymorphisme sur un grand nombre d’individus comme des analyses Ecotilling, DHPLC ou SSCP pourraient être envisagées. En effet, grâce à ces méthodes, des substitutions ou délétions d’un seul nucléotide peuvent être détectées Dans un deuxième temps, un clonage et séquençage de tous les allèles chez des génotypes présentant du polymorphisme seraient nécessaires. Le séquençage permettra de mettre en évidence les variations au niveau de la séquence génomique (exoniques et introniques) et permettra de prédire les modifications au niveau de la chaîne des acides aminés.

Nous avons réalisé le clonage et séquençage du gène monolocus Lcy-b dans un premier temps chez un représentant de chacun des trois taxons de base et chez les orangers. Les analyses RFLP et SSR avaient démontré l’hétérozygotie phylogénétique des orangers pour ce gène (pamplemoussier/mandarinier) mais ne révélaient pas de polymorphisme intervariétal. Toutefois les analyses DHPLC témoignaient d’une variabilité de la séquence codante entre trois de ces orangers (Shamouti, Cara Cara, Sanguinelli) et une orange très pauvre en caroténoïdes, l’orange Huang pi Chen. Le séquençage du gène Lcy-b a permis de confirmer l’hypothèse sur l’homozygotie des taxons de base pour ce gène (seul le pamplemousse sans pépin présente une hétérozygotie limitée à deux bases) et l’hétérozygotie des orangers qui présentent un allèle identique à l’allèle de pamplemoussier et un allèle identique à l’allèle de mandarinier. L’allèle de pamplemoussier pourrait être impliqué dans une variation de l’activité de l’enzyme LCY-b. Etant donné que l’oranger Cara Cara présente un allèle de

pamplemoussier et un allèle de mandarinier comme les autres orangers, le phénotype de cette orange (accumulation préférentielle des carotènes) ne paraît alors pas lié à la diversité allélique du gène Lcy-b. Ces analyses devraient être étendues à un échantillon plus large surtout pour les espèces C. maxima et C. paradisi pour lesquelles des structures génotypiques particulières ont été mises en évidence pour le gène Lcy-b et qui pourraient être impliquées dans l’arrêt de la chaîne de biosynthèse et l’accumulation du lycopène. De plus nous avons montré que l’expression du gène Lcy-b varie peu dans les sacs à jus du pamplemousse Deep Red au cours de la maturation des fruits et reste à un faible niveau. L’étude de la séquence génomique de ce gène et de ses séquences promotrices chez les pamplemoussiers et pomelos permettrait de préciser la régulation liée à ce polymorphisme. Une autre approche serait l’étude de populations hybrides obtenues à partir d’un génotype accumulant du lycopène et d’un autre génotype accumulant des xanthophylles comme les mandarines, clémentine ou oranges et la recherche de QTLs. Il serait intéressant de localiser le gène Lcy-b sur une carte génétique et de confronter la localisation du gène candidat et celle des QTLs.

Diversité d’expression des gènes de la chaîne de biosynthèse

Chez la tomate, fruit climactérique et servant de modèle pour le processus de développement des fruits et de la maturation, les variations de couleur semblent majoritairement liées à des modifications d’expression génique. Notre troisième objectif était ainsi d’analyser le niveau d’expression des principaux gènes de biosynthèse des caroténoïdes chez différentes variétés d’une même espèce et chez au moins une espèce de chacun des trois groupes précédemment établis. Nous avons analysé le niveau d’expression des gènes Dxs,

Psy, Pds, Zds, Lcy-b, Hy-b et Zep et les différences inter et intraspécifiques. Le niveau

d’expression des gènes joue un rôle important dans la synthèse et l’accumulation des caroténoïdes dans les sacs à jus des agrumes. L’augmentation des quantités de transcrits des gènes Dxs, Psy, Pds, Zds, Hy-b et Zep s’accompagne de l’accumulation des β,β-xanthophylles dans les sacs à jus des oranges Shamouti et Sanguinelli. De plus, la faible concentration en caroténoïdes totaux dans les sacs à jus de l’orange Huang pi Chen serait liée à une sous-expression des gènes Dxs et Psy chez cette orange par rapport aux niveaux d’sous-expression relevés dans les oranges Shamouti, Sanguinelli et Cara Cara. La sous-expression du gène Dxs ou du gène Psy semble aussi influencer les faibles teneurs en caroténoïdes totaux dans les sacs à jus du citron Eureka et du pamplemousse Deep Red. Ainsi, l’étape catalysée par PSY ne serait pas la première étape limitante dans la synthèse des caroténoïdes chez les agrumes. L’expression du gène Dxs, codant pour une enzyme catalysant la première étape de la voie du MEP influencerait la synthèse des caroténoïdes et serait coordonnée avec celle du gène Psy. De plus, le polymorphisme dans la séquence du gène Lcy-b précédemment mis en évidence

Conclusion et Perspectives

173 pourrait aussi être à l’origine de la sous-expression de ce gène chez les pamplemoussiers et pomelos et de l’accumulation du lycopène dans les sacs à jus de ces derniers. Enfin, l’absence de β-cryptoxanthine dans les jus des pamplemousses semble due à la sous-expression du gène

Hy-b.

Relations entre la biosynthèse de l’acide abscissique et les teneurs en caroténoïdes

Notre travail n’a pas abordé l’étude de l’acide abscissique qui est un composé majeur du catabolisme des caroténoïdes. Cette hormone joue un rôle fondamental dans la maturation des graines et dans la transduction du signal permettant la régulation des flux d’eau par la fermeture des stomates. L’acide abscissique est formé à partir de la dégradation de la cis-violaxanthine ou de la cis-néoxanthine par l’action de la 9-cis-époxy hydroxy caroténoïde dioxygénase (NCED). Dans notre étude, nous avons également formulé deux hypothèses sur les différences interspécifiques au niveau de l’accumulation des caroténoïdes et la dégradation de la cis-violaxanthine pour la synthèse de l’acide abscissique : (1) la faible concentration en caroténoïdes totaux des jus de l’orange Huang pi Chen ou du pamplemousse Deep Red serait liée à la sous-expression des gènes Dxs et Psy et non à la dégradation de la cis-violaxanthine pour la synthèse de l’acide abscissique ; (2) le phénotype du citron Eureka serait associé à la sous-expression du gène Dxs et à la surexpression de Nced. Une étude de la synthèse de l’acide abscissique et de l’expression des gènes Nced chez des variétés d’agrumes représentant les trois taxons de base est nécessaire pour confirmer ces hypothèses. Par ailleurs, les hormones (éthylène, gibbérellines et acide abscissique) contrôlent le développement, la maturation et l’abscission des fruits. Des traitements avec de l’éthylène ou les gibbérellines sont utilisés pour modifier la coloration de la peau des agrumes. L’éthylène favorise la transformation des chloroplastes en chromoplastes et entraîne ainsi une modification de la couleur des fruits. A l’inverse, les traitements avec les gibbérellines retardent le changement de couleur de la peau des agrumes. Les résultats de RODRIGO et al. (2006) suggèrent aussi qu’un traitement à l’éthylène favorise la synthèse de l’acide abscissique et augmente l’expression des gènes Nced dans le flavédo de l’orange Navelate. Cependant, les mécanismes de régulation sont complexes et nous manquons d’information sur la production endogène de ces hormones chez les agrumes, fruits non climactériques, et leur rôle sur la coloration des fruits et en particulier sur la coloration de la pulpe.

Etude de l’accumulation des caroténoïdes chez les espèces riches en micronutriments dans des situations de stress : étude des facteurs environnementaux

Nous avons montré que le facteur génétique est un élément majeur de la diversité des compositions en caroténoïdes de la pulpe des agrumes ; les autres facteurs comme l’origine

géographique ou les pratiques culturales étant minimisés. En revanche, nous n’avons pas abordé dans ce travail les facteurs de régulation exogènes (température, lumière, etc.). Nous savons que la température joue un rôle important dans la coloration des agrumes, comme en témoignent les oranges produites en climat tropical qui restent vertes à maturité. Les oranges des zones méditerranéennes sont plus riches en caroténoïdes totaux que les oranges issues des zones tropicales et subtropicales. La coloration de la peau des fruits dépend de la dégradation des chlorophylles et de la synthèse des caroténoïdes. Ces deux processus seraient eux-mêmes influencés par le froid, la lumière et l’éthylène. Dans les feuilles, l’augmentation de l’expression du gène CsNced1 et la synthèse de l’acide abscissique peuvent être induits par un stress hydrique (RODRIGO et al., 2006). Des travaux chez la tomate montrent que plusieurs loci en plus de ceux des gènes de biosynthèse des caroténoïdes jouent un rôle dans la diversité des compositions en caroténoïdes des fruits. Les études chez la tomate suggèrent que des gènes impliqués dans la transduction du signal lumineux influencent la synthèse des caroténoïdes : gènes LeCOP1LIKE (numéro d’accession GenBank AW525993) et LeHY5 (numéro d’accession GenBank AI897283) (LIU et al., 2004).

L’étude du rôle des facteurs environnementaux peut être réalisée par l’analyse de l’expression des gènes de biosynthèse des caroténoïdes, des gènes responsables de la synthèse des précurseurs, des gènes impliqués dans la formation de l’acide abscissique dans des conditions de stress (hydriques, salins), des gènes responsables de la transduction du signal lumineux, etc. La quantification des transcrits par puces à ADN permet l’analyse simultanée de l’expression de centaines voire de milliers de gènes. L’utilisation de tels outils faciliterait l’analyse de l’impact environnemental sur l’accumulation des caroténoïdes dans la pulpe des fruits.

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