Les PBPs de faible masse moléculaire

Les PBPs de faible masse moléculaire sont des endopeptidases ou des D,D-CPases qui ne sont pas essentielles à la survie de la bactérie (Denome et al., 1999; Schuster et al., 1990).

E. coli compte 6 PBPs de faible masse moléculaire. 3 d’entre elles (PBP4, PBP7 et PBP8) possèdent une activité D,D-endopeptidase qui hydrolyse le pontage peptidique entre l’acide diaminopimelique et la D-alanine. Parmi les 4 autres (PBP4, PBP5, PBP6 et PBP6b) qui sont des D,D-Cpases, PBP5 est impliquée dans le maintien de la morphologie d’E. coli (Nelson et Young, 2001; Nelson et Young, 2000).

La seule PBP de faible masse moléculaire de S. pneumoniae, PBP3, est homologue de PBP5 d’E. coli. Le gène dacA code pour le précurseur de PBP3, une protéine de 413 résidus, dirigé vers la membrane interne via un peptide signal N-terminal clivable (Figure 6B). La maturation du précurseur au cours de sa translocation vers le périplasme résulte en une protéine de 392 résidus, PBP3, qui s’associe à la membrane par l’intermédiaire d’une vingtaine de résidus C-terminaux. Il a été prédit que ces mêmes résidus C-terminaux chez PBP5 d’E. coli formerait une hélice α amphiphile (Jackson et Pratt, 1987; Phoenix, 1990).

PBP3 et PBP5 sont capables de se lier aux β-lactamines. Contrairement à PBP3 et à la plupart des PBPs, PBP5 possède une activité d’hydrolyse des β-lactamines relativement élevée (Nicholas et Strominger, 1988). PBP3 et PBP5 possèdent une activité D,D-CPase in vitro (Amanuma et Strominger, 1980; Hakenbeck et Kohiyama, 1982; Tamura et al., 1976) et in vivo (Matsuhashi et al., 1979; Severin et al., 1992). Cette activité est caractérisée par le clivage du dernier résidu D-Ala de la chaîne pentapeptidique du PG et a été mise en évidence pour PBP3 par incubation d’extraits membranaires de la protéine avec un substrat UDP- muramyl[A2pm-3H]-pentapeptide (Hakenbeck et Kohiyama, 1982).

III.2.3.1. Structure tri-dimensionnelle de PBP5 d’E. coli

La structure tridimensionnelle du mutant sPBP5’ de PBP5 a été résolue à 2.3 Å de résolution (Davies et al., 2001). Le préfixe « s » indique une délétion des 17 derniers acides aminés C-terminaux, cette délétion augmente la solubilité de la protéine (Nicholas et Strominger, 1988). L’apostrophe indique la substitution de la glycine 105 par un aspartate, cette mutation s’accompagne d’une forte diminution de la vitesse d’hydolyse β-lactamines (Amanuma et Strominger, 1984). sPBP5’ est composée de deux domaines I et II orientés en angle droit et qui semblent relativement fixes l’un par rapport à l’autre (Figure 8A) (Davies et al., 2001). L’hélice C-terminale amphiphile est absente dans la forme cristallisée de PBP5 mais il est vraisemblable qu’elle viendrait se positionner à la base du domaine II et se déploierait sur la surface externe de la membrane cytoplasmique (Figure 9). Le domaine

globulaire N-terminal (domaine I) inclut le site actif de la protéine où sont présents les trois motifs caractéristiques de la famille ASPRE. Le repliement du domaine II C-terminal ne présente aucune similarité avec une structure protéique connue et son rôle n’a toujours pas été élucidé.

Figure 8. Représentation en ruban de la structure de sPBP5’ d’E. coli (A) et effet de l’inactivation de PBP3 de S. pneumoniae (B et C). A : Le domaine I de liaison à la pénicilline est orienté en angle droit par rapport au domaine II dont la fonction est inconnue. Le trait en pointillés marque la limite entre les deux domaines. Le site actif de sPBP5’ est bordé par un feuillet β composé de 5 brins anti-parallèles et un entrelacement d’hélices α, son entrée se situe sur le haut du domaine I. La boucle « Ω-like » impliquée dans l’activité de déacylation se situe entre les brins β5 et β6 (D’après Davies et al., 2001). B-C : Observation par microscopie électronique d’une coupe longitudinale de cellules d’une souche de pneumocoque sauvage (B) et d’une souche déficiente en activité D,D-CPase (C). Les pointes de flèches montrent les septa en croissance. C : Noter l’élargissement des cellules, l’apparition de septa sur différents plans de la cellule et l’épaisseur inégale de la couche de PG dans la souche mutante. La barre de mesure représente 1 µm (D’après Schuster et al., 1990).

III.2.3.2. Fonctions enzymatique et cellulaire des PBPs de faible masse moléculaire

L’inhibition spécifique des PBPs de faible masse moléculaire par des antibiotiques n’entrave pas la viabilité cellulaire (Hakenbeck et al., 1980; Spratt et Cromie, 1988; Zighelboim et Tomasz, 1980). Par ailleurs, des souches d’E. coli et de S. pneumoniae dans lesquelles sont respectivement inactivées PBP5 et PBP3 ont été obtenues (Nelson et Young, 2001; Schuster et al., 1990; Spratt, 1980). Ces deux observations indépendantes permettent de conclure que les CPases ne sont pas essentielles à la survie bactérienne. Toutefois, ces souches mutantes présentent de sévères aberrations morphologiques (Nelson et Young, 2001; Nelson et Young, 2000; Schuster et al., 1990). Chez le pneumocoque, les anomalies les plus significatives sont une apparition de multiples septa témoignant d’une désorganisation de la division, un élargissement des cellules qui adoptent une morphologie sphérique et un temps de génération pratiquement double de celui de la souche sauvage (Figure 8B et C) (Schuster et al., 1990). Une modification de la composition chimique du PG, compatible avec une déficience en activité D,D-CPase, est également observée chez les mutants dacA- de pneumocoque ou lorsqu’une souche sauvage est cultivée en présence d’acide clavulanique, inhibiteur spécifique de PBP3. Dans les deux cas, on observe une augmentation de la concentration en pentapeptides au détriment des tripeptides, majoritaires dans la souche sauvage (Severin et al., 1992; Severin et al., 1997).

Malgré ces diverses observations, les hypothèses concernant le rôle biologique des D,D-CPases se restreignent pour le moment à une régulation du degré de réticulation de la muréine et à une implication dans le maintien de la morphologie cellulaire (Holtje, 1998; Nelson et Young, 2001; Schuster et al., 1990).

Alors que l’activité D,D-CPase du domaine I a été mise en évidence, la fonction du domaine II est en revanche inconnue. Sur la base de la structure tridimensionnelle de sPBP5’, Davies et al. avaient proposé deux hypothèses. Selon la première, le domaine II jouerait le rôle d’un piédestal qui positionnerait le site actif près des couches inférieures du PG, en position idéale pour une interaction avec les peptides de la paroi. Selon la deuxième, le domaine II interagirait avec d’autres enzymes de synthèse de la paroi afin de recruter PBP5 vers les zones de synthèse du PG (Davies et al., 2001). En effet, les nombreuses structures β présentes sur ce domaine pourraient faciliter de telles interactions via des liaisons hydrogène établies entre des feuillets β. Nelson et al. ont créé des protéines hybrides en interchangeant les domaines I et II des D,D-CPases PBP5 et PBP6 d’E. coli. La protéine de fusion PBP 5I/6II

combinant le domaine I de PBP5 avec le domaine II de PBP6 parvient à complémenter la délétion de PBP5 (Nelson et al., 2002). Il en résulte que soit le domaine II ne participe à aucune interaction protéique et permet uniquement d’élever le site actif à une distance déterminée au-dessus de la membrane interne, soit que PBP5 et PBP6 participent au même complexe protéique (Nelson et al., 2002). En ce qui concerne le domaine I, la création d’hybrides interchangeant de courtes régions de ce domaine entre PBP5 et PBP6 a montré qu’une zone restreinte située autour du motif catalytique KTG déterminait la spécificité de PBP5. Il ressort de ces expériences que la morphologie cellulaire d’E. coli dépend essentiellement de l’activité enzymatique de PBP5 et de l’accessibilité du substrat à son site actif (Ghosh et Young, 2003).

Le rôle exact joué par l’hélice amphiphile des CPases reste assez obscur. Sa fonction première est d’associer les enzymes à la membrane cytoplasmique. En effet, lorsque PBP3 de S. pneumoniae et PBP5 d’E. coli sont délétées de leur hélice amphiphile, les protéines ne sont plus associées à la membrane et sont libérées dans le milieu de culture pour la première et dans le périplasme pour la seconde (Pratt et al., 1986; Schuster et al., 1990). Par ailleurs, Nelson et al. ont montré que la viabilité d’une souche d’E. coli était compromise lorsqu’elle exprimait une PBP5 délétée de son hélice amphiphile (Nelson et Young, 2001). Les auteurs en déduisent que l’association membranaire de PBP5 est nécessaire au contrôle exercé par la CPase sur la morphologie de la cellule en permettant de réguler le nombre de muropeptides accessibles à la protéine. Ils proposent que l’hélice amphiphile associée à la membrane restreindrait l’accès de PBP5 aux seules chaînes pentapeptidiques orientées vers la membrane interne (Figure 9) (Nelson et Young, 2001).

Figure 9. Positionnement spéculatif de la D,D-carboxypeptidase PBP5 dans le périplasme d’E. coli. La représentation schématique de PBP5 est basée sur la structure tri-dimensionnelle de la protéine résolue par Davies et al. en 2001. La protéine est associée à la membrane cytoplasmique par son hélice C-terminale amphiphile qui est absente dans le mutant sPBP5’ dont la structure a été résolue. L’entrée du site actif se situe sur le haut de la protéine, face à la couche de PG. PBP5 se déplacerait et cliverait les résidus D-Ala terminaux des chaînes peptidiques du PG orientées vers la membrane interne (D’après Nelson and Young, 2001).

Des expériences échangeant l’hélice amphiphile de PBP5 avec celles des trois autres CPases d’E. coli, PBP6, PBP4 et DacD ont été réalisées (Nelson et al., 2002). L’expression des hybrides de PBP5 avec PBP6 ou DacD ne s’accompagne pas d’un phénotype particulier, montrant ainsi que la capacité de l’hélice amphiphile à s’associer à la membrane plasmique repose non pas sur sa structure primaire mais sur sa structure tertiaire (Nelson et al., 2002). Bien qu’associé à la membrane cytoplasmique, l’hybride de PBP5 avec PBP4 s’est révélé déficient en activité CPase, montrant que l’association membranaire est nécessaire mais pas suffisante à la fonction physiologique de PBP5 (Nelson et al., 2002). Il se pourrait donc que l’hélice amphiphile établisse des interactions protéiques au sein d’un complexe multi- enzymatique, ou qu’elle soit impliquée dans le positionnement de la CPase dans le périplasme (Nelson et al., 2002).

IV. Modèles de synthèse du peptidoglycane pour les bacilles et les