Accessibilité de PBP3 à ses substrats pentapeptidiques

Si la disposition de PBP3 dans le périplasme est telle que celle proposée pour PBP5 par Nelson et al. (Nelson et Young, 2001) et que les chaînes glycanes sont orientées parallèlement à la membrane interne (Figure 19A et E), alors les dimensions de la protéine impliquent que seuls les pentapeptides monomériques des couches inférieures du PG seraient accessibles au site actif de PBP3 (peptides en rouge dans la figure 19A). Dans le cas d’une orientation des chaînes glycanes perpendiculaire à la membrane cytoplasmique (Dmitriev et al., 2003), PBP3 aurait accès aux pentapeptides mono ou multimériques proches des extrémités inférieures (pointant vers la membrane interne) des chaînes glycanes (peptides en rouge dans la figure 19B). La localisation bi-hémisphérique de PBP3 dans les cellules qui ne sont pas encore rentrées en division (voir la publication n°II) permettrait à la D,D-CPase de transformer tous ces pentapeptides en tétrapeptides incapables de servir de peptides donneurs dans la réaction de transpeptidation. Dans cette optique, le domaine C-terminal de PBP3 servirait donc à positionner le domaine catalytique de la protéine au plus près de ses substrats peptidiques.

S’il existe des précurseurs polysaccharidiques du PG (Figure 19D), alors ces derniers doivent se situer très près des couches inférieures du PG au moment de leur incorporation au PG pré-existant. La verticalité serait donc la disposition de PBP3 la plus favorable à une interaction avec ces substrats-ci.

Pour atteindre les peptides portés par le lipide II, PBP3 devrait basculer d’environ 90° (Figure 19F), par rapport à l’orientation proposée précédemment, pour se rapprocher de la membrane interne. Le mécanisme d’association de PBP3 à la membrane cytoplasmique, via l’hélice C-terminale amphiphile, devrait autoriser un tel basculement. Si PBP3 adopte la position décrite dans la figure 19F, l’entrée du site actif se situerait à une trentaine d’Å au- dessus de la membrane interne, distance qui autoriserait difficilement l’entrée de la partie

peptidique du lipide II. En effet, l’extrémité d’un pentapeptide porté par le lipide II ne s’élève pas à plus de 25 Å au-dessus de la membrane cytoplasmique. Pour que PBP3 parvienne à se rapprocher suffisamment de la membrane, il faudrait donc que l’enzyme bascule sur son flan. Cette hypothèse est peu probable car la charge négative portée par la totalité de la surface de PBP3 créerait un phénomène de répulsion avec les têtes polaires, chargées négativement, des lipidiques de la membrane cytoplasmique.

Même si PBP3 est dotée d’une certaine flexibilité, seules les hypothèses d’une interaction de la CPase avec les pentapeptides portés par le PG pré-existant ou des chaînes polysaccharidiques précurseurs semblent donc véritablement plausibles. La position de l’enzyme la mieux adaptée à une interaction avec ces substrats serait celle qui est proposée dans la figure 19E, c’est-à-dire perpendiculairement à la membrane interne.

Au début du cycle cellulaire, PBP3 exercerait donc son activité D,D-CPase sur ces deux substrats potentiels ou sur un seul d’entre eux afin d’empêcher la synthèse de PG ailleurs qu’au futur site de division. L’exclusion de PBP3 du futur site de division permettrait de préserver les pentapeptides dans cette zone équatoriale d’où émergent les trois sites de synthèse du PG.

Au cours de la phase de synthèse du PG, les hypothèses concernant les substrats potentiels de PBP3 et le positionnement de la protéine sont les mêmes, et il semble toujours peu probable que la CPase agisse sur le lipide II. Si le lipide II n’est pas la cible de PBP3, c’est qu’il ne doit probablement pas être incorporé directement au PG pré-existant. Il serait donc pris en charge par les glycosyltransférases pour synthétiser des chaînes polysaccharidiques précurseurs qui sont, quant à elles, accessibles à PBP3. Au niveau du PG pré-existant et/ou des précurseurs polysaccharidiques, PBP3 transformeraient les pentapeptides en tétrapeptides, eux-même transformés en tripeptides par une L,D-CPase. Ces tripeptides seraient utilisés comme accepteurs de la réaction de transpeptidation (voir le paragraphe IV.4 dans la présentation bibliographique). Les pentapeptides portés par le lipide II et par les précurseurs polysaccharidiques seraient quant à eux utilisés comme donneurs de la réaction de transpeptidation. En régulant le nombre de pentapeptides et/ou de tripeptides présents dans les zones de néo-synthèse, PBP3 assurerait un contrôle du degré de réticulation du néo-PG.

Figure 19. Accessibilité de PBP3 à ses substrats peptidiques potentiels. A : Chaînes glycanes disposées parallèlement à la membrane cytoplasmique, position des couches inférieures de PG. B : Chaînes glycanes disposées perpendiculairement à la membrane cytoplasmique, position des extrémités des chaînes glycanes pointant vers la membrane interne. C : Disposition du lipide II. D : Disposition des chaînes polysaccharidiques précurseurs. Les traits épais symbolisent les chaînes glycanes, les traits fins symbolisent les peptides. Les substrats pentapeptidiques potentiels de PBP3 sont indiqués en rouge. Les cercles vert foncé correspondent au GlcNAc, les cercles vert clair au MurNAc et l’ellipse grise à l’undécaprénol. E-F : Orientation perpendiculaire (E) ou oblique (F) de PBP3 par rapport à la membrane cytoplasmique.

Malgré les efforts déployés depuis le milieu des années soixante pour élucider les mécanismes de croissance et de division bactériennes, ces deux processus restent encore aujourd’hui relativement mal compris. Dans le but de combler le manque de connaissances relatives à la croissance et la division du pathogène humain S. pneumoniae, nous nous sommes intéressés au cours de cette thèse au fonctionnement de ses PBPs, catalyseurs des dernières étapes de la biosynthèse du peptidoglycane. Pour ce faire, nous avons développé une méthode de double marquage par immunofluorescence permettant d’étudier le comportement cellulaire de cette famille de protéines (Publications n°I et II). Ces travaux ayant souligné le rôle central de la D,D-carboxypeptidase PBP3 dans la régulation de la division du pneumocoque, nous avons réalisé l’étude fonctionnelle et structurale de cette PBP de faible masse moléculaire.

Afin de discuter des conséquences biologiques de la localisation des protéines étudiées, nous avons émis l’hypothèse raisonnable que FtsZ et les PBPs exercent leur activité respective de constriction de la membrane et de synthèse du peptidoglycane au niveau de leur site de localisation. Nous avons montré que le pneumocoque possède trois sites de synthèse du PG (publication n°I). Au niveau des deux premiers sites dont la position coïncide avec celles des excroissances équatoriales de peptidoglycane, PBP2b, PBP2a et PBP1b catalysent l’insertion périphérique de néo-peptidoglycane. Au niveau du troisième site, site de division de la bactérie, PBP2x, PBP1a et PBP1b catalysent la synthèse du peptidoglycane septal. Bien qu’une co-localisation cellulaire n’engendre pas forcément des interactions protéiques, ces résultats sont en accord avec l’hypothèse selon laquelle des complexes multienzymatiques seraient associés à la synthèse du peptidoglycane. D’après nos résultats, un « élongasome », comprenant au minimum PBP2b et PBP2a, se chargerait de la synthèse du peptidoglycane périphérique alors qu’un « septasome », comprenant au minimum PBP2x et PBP1a, se chargerait de la synthèse du peptidoglycane septal. Il semble peu probable que la spécificité de ces complexes hypothétiques repose sur la présence d’une PBP de classe A particulière. En effet, bien que PBP2a et PBP1a soient impliquées spécifiquement dans le processus de croissance pour la première et de division pour la seconde, ces deux PBPs perdent leur rôle spécifique en l’absence de l’une ou de l’autre et sont capables de se remplacer mutuellement. Il semblerait donc que la spécificité du type de néo-peptidoglycane synthétisé par ces complexes potentiels résiderait dans la présence respective de PBP2b ou de PBP2x, donc d’une PBP de classe B particulière. Ces deux PBPs sont d’ailleurs essentielles à la survie du pneumocoque. Chacune de ces PBPs pourrait interagir spécifiquement avec l’une des deux PBPs de classe A dans le contexte de type sauvage. La recherche d’éventuelles interactions