Les différents volets de recherche réalisés dans cette thèse sont énoncés ci-dessous :
Production de lipides par des microorganismes hétérotrophes oléagineux (Chapitre 2, article revue publié dans Critical Reviews in Environmental Science and Technology (2014) 44, 416- 453);
Optimisation de la production de lipides par Y. lipolytica et étude de la performance du procédé à l’échelle du fermenteur (Chapitre 3, article de recherche publié dans RSC Advances (2016) 6, 90547-90558);
Morphologie et comportement rhéologique de Y. lipolytica : effet de la concentration d’oxygène dissous sur la croissance cellulaire et la composition de lipides (Chapitre 4, article de recherche soumis à Energy);
Utilisation d’acide citrique et de cofacteurs essentiels afin d’améliorer la production de lipides par Y. lipolytica à partir de milieu de culture à base de glycérol brut (Chapitre 5, article de recherche soumis à Applied and Environmental Microbiology);
Valorisation du glycérol brut et des déchets de crustacés pour la synthèse de produits à valeur ajoutée par Y. lipolytica (Chapitre 6, article de recherche soumis à Engineering Life Sciences);
Étude comparative entre les micro-ondes et les ultrasons pour la transestérification in situ de lipides microbiens (Chapitre 7, article de recherche publié dans RSC Advances (2016) 6, 56009-56017);
Co-culture pour la production de lipides : développements et défis (Chapitre 8, article revue publié dans Biomass and Energy (2016) 92, 20-30).
1.4.1
Production de lipides par des microorganismes hétérotrophes oléagineux
Cette revue bibliographique a permis de faire le bilan des connaissances sur les lipides levuriens en fonction de leur nature, leurs fonctions et leurs métabolismes de synthèse, d’accumulation et de dégradation. L’analyse a mis en évidence différents facteurs influençant le processus de lipogenèse. Il en ressort les points forts suivants. Yarrowia lipolytica, une levure oléagineuse, est un modèle d’étude privilégié et un microorganisme d’intérêt industriel pour ses produits. Les études disponibles se limitent cependant aux substrats glucidiques et à ceux hydrophobes. Raressont les travaux relatifs à l’accumulation de lipides par cette souche à partir de glycérol brut, un substrat d’intérêt dans le domaine d’application visé dans cette étude. Le glycérol est un candidat intéressant par sa capacité élevée de réduction et sa structure chimique à la base des TAG. De plus, le glycérol étant un coproduit des voies classiques de production de bioester, son avantage dans les bioprocédés est indéniable.
1.4.2
Optimisation de la production de lipides par Y. lipolytica et étude de la
performance du procédé à l’échelle du fermenteur
Cette partie de la recherche visait à optimiser les principaux paramètres de production de lipides à partir de glycérol brut en utilisant la levure Y. lipolytica SM7. Les paramètres ont été optimisés par une méthode des surfaces de réponses (MSR) en utilisant la technique de Box Behnken. Les paramètres étudiés étaient la concentration de glycérol brut (75 à 100 g L-1), la concentration
d’hydroxyde d’ammonium (0,5 à 1,5 g NH4OH L-1) et le temps de fermentation (36 à 72 h). Les
essais ont été réalisés dans un fermenteur de 5 L de capacité avec une température maintenue à 28oC et un pH stabilisé à 6,5 ± 0,5. Une production maximale de 52,7 ± 1,2% (p/p) de lipides,
correspondant à une concentration de biomasse de 25,8 ± 1,5 g L-1 et une teneur en lipides de
13,6 ± 0,8 g L-1, a été obtenue avec un apport initial de 89 g L-1 de glycérol brut, 0,54 g L-1 de
NH4OH et un temps de fermentation de 66 h. Les conditions optimales ont ensuite été testées,
sans réduction d’efficacité, en utilisant une fermentation en deux étapes, soit en réduisant la teneur en oxygène dissous de 60% à 30% après 18 h de fermentation. Finalement, les lipides produits par Y. lipolytica SM7 ont été caractérisés et contiennent principalement des acides oléique, palmitique, linoléique et stéarique, lesquels peuvent servir de précurseurs à la synthèse de biodiesel.
1.4.3
Morphologie et comportement rhéologique de Y. lipolytica : effet de la
concentration d’oxygène dissous sur la croissance cellulaire et la
composition de lipides
La levure aérobie stricte Y. lipolytica cultivée en limitation d’azote produit des acides gras de moins en moins insaturés en fonction de la diminution du taux d’oxygène dans le milieu. L’étude des variations de l’oxygène dissous lors de la phase d’accumulation lipidique a été menée après 18 h de fermentation. Toutefois, lors du passage de la phase de croissance à la phase d’accumulation de lipides, la demande en oxygène est moins importante. Trois scénarios de
variation de l’aération ont été testés, 15-20%, 30-35% et 40-60%, en modifiant le coefficient de transfert d’oxygène (70, 80 et 100 h-1, respectivement). Lors de la culture d’Y. lipolytica SM7, le
coefficient de transfert d’oxygène (kLa) a atteint des valeurs supérieures à 280 h-1 en phase de
croissance et s’est stabilisé pendant la phase d’accumulation entre 50 et 80 h-1. Une analyse
morphologique et rhéologique a été menée montrant un bouleversement de la morphologie cellulaire selon les différentes phases de croissance et d’accumulation des lipides. Un phénomène important de dimorphisme a été observé chez les cellules habituellement ovoïdes, quelques fois allongées de 5 à 6 µm, caractéristiques d’Y. lipolytica. Deux populations ont été distinguées, des cellules filamenteuses et les cellules ovoïdes courantes. Les cellules filamenteuses s’enchaînaient en un pseudo-mycéllium linéaire rarement branché et dissocié les uns des autres. Une étude par granulométrie laser a également été réalisée, ce qui a permis d’avoir des mesures de distribution des tailles des différentes cultures soumises aux différents degrés d’oxygénation. Ces analyses de distribution volumique permettent de définir une distribution monomodale. En effet, après 18 h, les cellules produisent des filaments, ce qui confirme le dimorphisme observé chez Y. lipolytica et l’effet d’une limitation en oxygène sur la filamentation et l’accumulation de lipides.
1.4.4
Utilisation d’acide citrique et de cofacteurs essentiels afin d’améliorer la
production de lipides par Y. lipolytica à partir de milieu de culture à base
de glycérol brut
L’enzyme clé de la synthèse des acides gras est l’acétyl-CoA carboxylase qui catalyse la formation du malonyl-CoA. Cette enzyme se trouve dans le cytoplasme et elle est biotine dépendante. Elle est considérée par certains auteurs comme l’étape limitante de la synthèse d’acides gras. L’acétyl-CoA provient essentiellement, pour les microorganismes oléagineux, de la production de citrate par le cycle des acides tricarboxyliques. Ce citrate est ensuite exporté vers le cytosol et transformé en acétyl-CoA et en oxaloacétate grâce à l’ATP citrate lyase, l’enzyme clé des microorganismes oléagineux. Par ailleurs, la biotine est responsable de l’activation de β-hydroxy-β-methylglutaryl-CoA, une enzyme intramitochondriale qui stimule l’accumulation des stérols et active la génération d’acétoacétate et d’acétyl-CoA. Cette partie de la thèse a donc été consacrée à l’étude de l’effet d’un ajout de biotine et de leucine sur les teneurs en lipides accumulés par Y. lipolytica SM7. La teneur en lipides de Y. lipolytica était fortement influencée par l'ajout de biotine, une augmentation de la concentration en biotine de 25 à 200 µg L-1 a permis d‘augmenter la quantité de lipides à 15 g L-1. Par ailleurs, pour canaliser le
flux métabolique dans la biosynthèse des lipides, un ajout d'acide citrique en tant que précurseur de lipides a conduit à une augmentation de l'activation du catabolisme total et de l'accumulation des lipides pour atteindre environ 63% (p/p). Il ressort donc que cette approche biochimique peut être une voie intéressante pour améliorer l'efficacité de la production de lipides.
1.4.5
Valorisation du glycérol brut et des déchets de crustacés pour la synthèse
de produits à valeur ajoutée par Y. lipolytica
Dans cette partie de la recherche, différents types de tensioactifs et d’huiles ont été utilisés en complément du glycérol brut afin d’améliorer la production de lipides et de lipases par la levure Y. lipolytica SM7. Les ajouts qui ont été testés sont l’huile végétale, l’huile à moteur et certains surfactants (Tween 20, Tween 80, Triton 100) à des concentrations de 5%. Les résultats ont montré qu'un milieu de culture composé de glycérol brut et d'huile d'olive peut augmenter l'activité de la lipase jusqu’à 25 U mL-1 et la teneur en lipides jusqu'à 35% (p/p). La fortification du milieu
avec des déchets de crustacés a augmenté l'activité de la lipase jusqu'à 38 U mL-1. L'activité
hydrolytique des lipases extracellulaires produites dans le milieu était satisfaisante, ceci ouvrant la voie à une utilisation dans d'autres procédés biotechnologiques.
1.4.6
Étude comparative entre les micro-ondes et les ultrasons pour la
transestérification in situ de lipides microbiens
L’extraction usuelle des lipides à partir des microorganismes oléagineux nécessite de grandes quantités de solvants organiques. Une approche prometteuse afin de contourner ce problème consiste à réaliser l’extraction et la transestérification des lipides en biodiesel en une seule étape. Deux méthodes de transestérification in situ (micro-ondes et ultrasonication) ont été comparées sur la base de leurs rendements de conversion et de leur performance. Les paramètres de ces procédés ont été optimisés par une méthode des surfaces de réponses (MSR) en utilisant la technique de Box Behnken. Les paramètres étudiés étaient la température, le temps de réaction, la concentration de catalyseur, et le ratio méthanol/lipides. En utilisant la technique des micro- ondes, des rendements de 99,0 ± 0,5% de conversion des esters méthyliques (lipides convertis/lipides totaux) ont été obtenus en présence d’un ratio molaire de méthanol/lipides de 183:1 et 2% de NaOH pendant 20 min à 100°C.
En comparaison, l’utilisation de la technique des ultrasons a permis des rendements de 95,1 ± 0,2% avec le même ratio méthanol/lipides et 3% de NaOH durant 20 min à 25°C. Le profil final des esters méthyliques était entièrement compatible avec celui du procédé classique à base de chloroforme et de méthanol et l'extraction a nécessité 12 h.
1.4.7
Co-culture pour la production de lipides : développements et défis
L’utilisation de communautés microbiennes pour la production de biocarburants est devenue une approche importante parmi les procédés biochimiques courants. La co-culture a été amplement étudiée dans le but de répondre aux limitations de l'utilisation du substrat par des souches individuelles pour obtenir d'autres bioproduits. Les effets de cette stratégie sur la productivité de lipides ne sont toutefois pas bien connus. Malgré les nombreuses recherches effectuées sur la production de lipides par des microorganismes oléagineux, la stratégie de co-culture a été bien examinée seulement chez certaines algues et la plupart des études se sont attardées sur les différents modes, par exemple hétérotrophe et mixotrophe. La littérature livre peu d'informations sur les stratégies d'amélioration de la production de lipides avec d'autres espèces que les micro- algues. Cette partie de la thèse décrit plusieurs systèmes de co-culture existants pour améliorer la productivité de biomasses et de lipides chez d’autres espèces. Un aperçu des stratégies de culture des micro-algues pour la production de lipides est d’abord présenté. Par la suite, un résumé des autres stratégies rapportées dans la littérature pour d’autres espèces est exposé. Enfin, les avantages et les inconvénients de cette approche, ainsi que les possibilités de surmonter les difficultés sont examinés.