Particules commerciales

Il existe de nombreux fournisseurs de particules magnétiques commerciales38, 39 : Chemagen, Ademtech, Dynal®, Merck en sont quelques exemples. Ces particules magnétiques servent principalement à des séparations spécifiques : ADN, ARN, anticorps, protéines, cellules marquées, etc. Certaines d’entre elles sont vendues avec une surface fonctionnalisée avec des acides carboxyliques afin que le client puisse fonctionnaliser lui-même ses particules avec un oligonucléotide aptamère, un peptide ou même une protéine. Cette fonctionnalisation repose sur la formation d’une fonction amide, provenant du couplage entre un acide carboxylique de la particule et une amine de la biomolécule. Le critère de monodispersité en taille des particules n’est pas toujours nécessaire pour les applications de séparation magnétique (cf. particules magnétiques Ademtech). Cependant lorsque les particules sont de même taille, la surface disponible est similaire pour toutes les particules, ce qui peut améliorer la reproductibilité des réponses vis-à-vis des microorganismes.

En ce qui concerne la morphologie et la composition des particules elles-mêmes, les fournisseurs n’en indiquent pas toujours la nature. Cette partie va néanmoins lister les différentes caractéristiques fournies dans les notices de quatre fournisseurs : Dynal®, Ademtech, Merck et Chemagen. Un tableau

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récapitulatif de leurs caractéristiques (Tableau 1) est disponible à le fin de cette partie. Cela permettra par la suite d’avoir une référence pour les performances des particules magnétiques synthétisées dans le cadre de notre travail.

Ademtech commercialise deux gammes de particules : Adembeads et MasterBeads. Les particules Adembeads ont un diamètre d’environ 200 ou 300 nm avec un coefficient de variation de 20 %, tandis que les particules MasterBeads sont des particules d’environ 500 nm de diamètre avec un coefficient de variation de 25 %. Dans les deux cas, le taux d’oxyde de fer est de 70 % en masse. La magnétisation à saturation des particules Adembeads est d’environ 40 emu g-1. Ademtech commercialise des particules fonctionnalisables mais aussi pré-fonctionnalisées avec des anticorps, des protéines ou de la streptavidine (Figure 10). Cette large gamme de particules permet des applications dans la séparation d’ADN/ARN, de cellules, de protéines et également de virus.

Figure 10 : Schéma représentant différentes fonctionnalisations possibles pour des particules magnétiques commerciales

Les particules Dynalbeads®, commercialisées par Dynal® et issues du brevet d'Ugelstad40, sont disponibles soit avec un diamètre de 1,15 μm, soit avec un diamètre de 2,8 μm. Les particules sont monodisperses en taille avec un coefficient de variation inférieur à 3%. La composition des particules ainsi que leur teneur en oxydes de fer ne sont pas indiquées dans les notices. En revanche, on retrouve quelques données dans le brevet d’Ugelstad.40 Le matériel magnétique utilisé dans les particules magnétiques est à base de fer, éventuellement associé au manganèse, cobalt ou nickel. Ces ferrites sont dispersées dans une matrice de polymère. Une publication caractérisant les particules MyOne™ indique que le taux de matériel magnétique est de 25,5 % et que la magnétisation à saturation est d’environ 23,5 emu g-1 pour les particules de 1 μm de diamètre.41 La notice indique qu’il existe plusieurs fonctionnalisations pour ces particules pour des applications variées : séparation de cellules, d’acides nucléiques, d’ARN, de peptides et de protéines.

Merck produit deux types de particules magnétiques très différentes : des microsphères, commercialisées sous le nom d’Estapor® Microsphere et des nanoparticules commercialisées sous le nom MagPREP® Silica. Les Estapor® Microsphere sont composées de ferrites et de polystyrène (PS) réticulé ou non avec du divinylbenzène (DVB). Ces microsphères sont disponibles avec différents diamètres selon leur fonctionnalisation. Le diamètre peut varier de 300 – 500 nm à 1,7 – 2,6 μm. Le taux d’oxyde de fer est compris entre 13 et 60% avec une magnétisation à saturation variant de 6 à 24 emu g-1 respectivement. Les fonctionnalisations permettent des applications à la purification

33 d’antigènes, d’anticorps et d’acides nucléiques. Les particules MagPREP® Silica sont quant à elles des particules bipyramidales composées de magnétite à plus de 95% et de silice. Contrairement aux autres particules décrites dans cette partie, ces particules ne sont pas sphériques et ne contiennent pas de polymère. Leur taille est également plus petite que pour les autres particules commerciales, puisqu’elle se situe aux environs de 100 nm. Elles ont pour application principale la purification d’acides nucléiques, mais la notice indique également qu’elles peuvent être utilisées pour l’adsorption de cellules, voire de virus et de bactéries.

Il n’existe qu’un seul kit de particules magnétiques commercialisé dans le but de séparer à la fois des bactéries et leurs ADN une fois lysés. Il s’agit du kit Bugs‘n Beads développé par Genpoint, qui a été racheté par Norda ASA (anciennement NorDiag), mais il n’existe plus de revendeurs en Europe. Les particules magnétiques utilisées dans ce kit proviennent de Chemagen et sont disponibles sous deux gammes de tailles : 0,5 – 1 μm et 1 – 3 μm. La dispersion de taille n’est pas indiquée, mais elle semble élevée au vu du graphique fourni dans leur notice (Figure 11). Ces particules sont composées de magnétite à 50-60 % et d’alcool polyvinylique (PVA). Le brevet concernant l’application à la séparation de microorganismes indique que leurs surfaces ont été modifiées par des polysaccharides (mannose, gomme de guar, carraghénine, etc).37 Les inconvénients de ces particules sont que l’échantillon doit être mis en culture une nuit avant d’effectuer cette séparation et qu’elles nécessitent un temps de séparation d’environ deux minutes.

Figure 11 : Histogramme représentant la dispersion de taille des particules Chemagen de 1 à 3 μm de diamètre. Extrait de la notice des particules M-PVA SAVx.

De nombreux fournisseurs vendent des particules à base de polymère car ces derniers permettent d’obtenir des propriétés de surface variées et ajustables. Il est ainsi possible d’obtenir des particules hydrophiles ou hydrophobes, ou une fonctionnalisation directe avec des acides carboxyliques ou des amines. Malgré leurs variétés de composition, les applications des particules de latex magnétiques sont essentiellement tournées vers la séparation et la purification spécifique de biomolécules. La capture générique pour isoler des microorganismes demeure rare, à cause de la diversité chimique des surfaces des microorganismes. Cependant elle permettrait d’accélérer grandement les analyses microbiologiques. La séparation générique des microorganismes par des particules de latex magnétiques représente donc un enjeu important.

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Tableau 1 : Récapitulatif des différentes particules de latex magnétiques détaillées dans ce chapitre

Référence Diamètre des

particules ^Dispersion de taillea MS (emu g-1)

Taux d’oxyde

de fer (%) ^{Type de particules Cibles biologiques} séparées Ademtech - Adembeads ^{200 – 300 nm CV = 20 Nc} b 70 Polymère, fonctionnalisation carboxylate, amine... ADN/ARN, cellules, protéines, virus Ademtech - MasterBeads ^{500 nm CV = 25 40 70} Dynal 1,15 ou 2,8 μm CV < 3 23,5 2,5 Polystyrène fonctionnalisation carboxylate, amine... ADN/ARN, cellules, protéines, peptides Merck 300 – 500 nm ou 1,7 – 2,6 μm ^Nc

b 24 60 Polystyrène réticulé Anticorps, antigène,

acides nucléiques

Merck Silica 100 nm Ncb Ncb >95 Silice Acides nucléiques,

cellules, virus, bactéries

Genpoint 0,5 – 1 μm

ou 1 – 3 μm ^{élevée Nc}

b 50-60 Alcool

polyvinylique ^Bactéries

aCV = coefficient de variation ; bnon communiqué