Paramètres biologiques

 Minéralisation potentielle du carbone (mg C-CO₂ émis kg^-1 de sol sec) : La minéralisation

potentielle du carbone organique a été déterminée suivant la norme XP U44-163 (AFNOR, 2009) adaptée. Elle permet de faire une estimation combinée de l’activité microbiologique du sol et de la dégardabilité de sa matière organique en présence d’un cortège microbien donné en conditions optimales d’humidité et de température, en mesurant le dégagement de CO2

émis par le sol au cours du temps.

Pour chaque échantillon, 50 g de sol (matière sèche) ont été humidifiés pour atteindre 80 % de la capacité au champ. Un apport de solution de nitrate de potassium (1 g L^-1) a permis d’atteindre une concentration en azote de 200 mg N-NO3^- L^-1 de sol, de façon à ce que l’azote ne soit pas limitant. Le sol a été incubé dans une enceinte hermétique (bocal de qualité alimentaire « parfait ») de 2 L, en présence d’un flacon de soude (1 mol L^-1) de 20 mL et d’un bécher d’eau de 15 mL (figure 3.31). L’enceinte hermétique a été placée 180 jours dans une étuve à l’obscurité et à température constante de 28°C (figure 3.32). L’humidité du sol a été maintenue à 80 % de la capacité au champ par d’éventuel apport d’eau déminéralisée estimé par pesée toutes les deux à trois semaines. La quantité de CO₂ piégé par la soude au cours du temps a été mesurée par dosage colorimétrique (indicateur coloré : thymolphtaléine) au HCl (0.8 mol L^-1) de la soude restante après ajout de 10 mL de BaCl2 à 20 % (excès) permettant la précipitation des carbonates Na2CO3.

Pour le suivi au cours du temps de l’émission du CO2, les dosages ont été réalisés 1, 3, 7, 10, 15, 22, 29, 36, 43, 51 jours après le début de l’incubation, puis toutes les deux semaines jusqu’à atteindre 180 jours d’incubation. Chaque mesure s’est faite en triplicat, et trois bocaux « blancs » (même dispositif sans l’échantillon de sol) ont permis de mesurer le CO2

présent naturellement dans l’atmosphère et dissous dans l’eau apportée. La quantité de carbone minéralisé a été calculée en faisant la différence entre le C-CO₂ mesuré dans l’enceinte de l’échantillon et celui mesuré dans les bocaux « blancs ». Le carbone minéralisé a été exprimé en mg C-CO2 kg^-1 de sol sec et en en mg C-CO2 kg^-1 de carbone organique initial).

L’émission de C-CO2 au cours du temps a été modélisée selon l’équation 5 de premier ordre proposé par Collins et al. (1997), tel que :

𝐶_𝑚 = 𝐶_𝑚𝑎𝑥 ∗ (1 − 𝑒−𝑘𝑡) Eq. [5]

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4 tranches d’hydrocarbure : nC10 – nC16 ; nC16 – NC22 ; nC22 – nC30 ; nC30 – nC40 4 Toluène, Ethylbenzène, o-Xylène, m+p-Xylène, somme des BTEX

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Avec 𝐶_𝑚 le cumul de C-CO₂ émis au cours du temps (mg C-CO₂ kg^-1 de sol sec), 𝐶_𝑚𝑎𝑥 le pool de carbone minéralisable (mg C-CO2 kg^-1 de sol sec), 𝑘 le taux spécifique de minéralisation (jour^-1) et t le temps cumulé (jour).

Figure 3.312 : Enceinte hermétique d’incubation des échantillons de sol pour le suivi de la minéralisation potentielle du C

Figure 3.32 : Etuve maintenue à 28°C et à l’obscurité

𝐶_𝑚𝑎𝑥 peut être considéré comme le pool de carbone labile, ce qui permet de calculer le pool de carbone résistant (équation 6) :

𝐶_𝑅 = 𝐶𝑂𝑇 − 𝐶_𝑚𝑎𝑥 Eq. [6]

Avec 𝐶_𝑅 le pool de carbone résistant (g kg^-1 de sol sec), 𝐶𝑂𝑇 la teneur en carbone organique total (g kg^-1 de sol sec) et 𝐶_𝑚𝑎𝑥 le pool de carbone labile (g kg-1

de sol sec).

 Biomasse microbienne du sol (mg C kg^-1 de sol sec) : la biomasse microbienne du sol a été

déterminée suivant la norme NF ISO 14240-2 (AFNOR, 1997) adaptée de la méthode de fumigation-extraction de Vance et al. (1987). Cette mesure s’est faite sur des échantillons frais, idéalement prélevés le jour même ou conservés au maximum 48 h à 4°C. Chaque échantillon a été tamisé à 5 mm et séparé en trois sous-échantillons homogènes : deux de 24 g et un de 50 g. L’échantillon de 50 g a servi à déterminer l’humidité massique de l’échantillon (Cf. 4.3. paramètres physiques). L’un des échantillons de 24 g a été fumigé avec des vapeurs de chloroforme (CHCl3) pendant 16 h dans une enceinte sous vide. Le chloroforme provoque la lyse des cellules des micro-organismes qui libèrent alors leurs contenus cellulaires dans le sol. L’autre échantillon de 24 g ne subit pas cette étape. Puis le carbone organique soluble des

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deux sous-échantillons de 24 g est extrait à l’aide de 100 mL d’une solution de K₂SO₄ à 0.025 mol L^-1, après agitation par retournement pendant 1 h et filtration sur papier Whatman®. Le carbone organique dissous de chaque sous-échantillon a été mesuré par la méthode d’oxydation catalytique par combustion à 680°C à l’aide d’un TOC-L Shimadzu total organic carbon analyzer. La quantité de carbone extractible microbien a été calculée grâce à la relation suivante (équation 7) :

𝐶𝑂𝑀 = 𝐶𝑂_{𝑓𝑢𝑚𝑖𝑔é}− 𝐶𝑂_{𝑛𝑜𝑛 𝑓𝑢𝑚𝑖𝑔é} Eq. [7] Avec 𝐶𝑂𝑀 le carbone organique extractible microbien (mg C kg-1

de sol sec), 𝐶𝑂_{𝑓𝑢𝑚𝑖𝑔é} le carbone organique extractible après fumigation de l’échantillon de sol (mg C kg-1

de sol sec) et 𝐶𝑂_{𝑛𝑜𝑛 𝑓𝑢𝑚𝑖𝑔é} le carbone organique extractible sur l’échantillon de sol brut non fumigé (mg C kg^-1 de sol sec).

La biomasse microbienne a été calculée selon l’équation 8 : 𝐵𝑀 = ^𝐶𝑂𝑀_𝑘

𝐸𝐶 Eq. [8] Avec 𝐵𝑀 la biomasse microbienne du sol (mg C kg-1

de sol sec), 𝐶𝑂𝑀 le carbone organique extractible microbien (mg C kg^-1 de sol sec) et 𝑘_𝐸𝐶 un coefficient égal à 0.45 déterminé par Joergensen (1996).

 Tests écotoxicologiques : Les tests écotoxicologiques ont été réalisés par le laboratoire certifié Inovalys, d’après le protocole « HP14 : dangerosité des sédiments » du Ministère de l’Ecologie, de l’Energie, du Développement Durable et de la Mer (MEEDM) établi pour les sédiments marins et continentaux d’Octobre 2009. Les essais obligatoires ainsi que les essais optionnels (Figure 34) ont été réalisés.

L’absence d’eau interstitielle en quantité suffisante dans les échantillons de sol n’a pas permis de réaliser le test « eau interstitielle testé par Vibiro fischeri ». La lixiviation des échantillons a été faite selon la norme NF EN 12457-2 (AFNOR, 2002) sur les échantillons bruts centrifugés et les éluats ont été filtrés à 0.45 µm. Le test de toxicité aigüe se compose en deux parties. La première a été réalisée selon la norme NF EN ISO 6341 (AFNOR, 2012) sur la Daphnie (Daphnia magna). Ce test repose sur la détermination de la CE50% c’est-à-dire la concentration efficace provoquant un effet (l’immobilisation) sur 50 % des Daphnies mises en expérimentation. La deuxième partie du test de toxicité aigüe a été réalisée selon la norme NF EN ISO 11348-3 (AFNOR, 2009) sur Vibrio fischeri (test microtox).

Ce test repose sur la détermination de l’inhibition de la luminescence émise par une bactérie marine Vibrio fischeri. Cet essai permet de déterminer la concentration d'échantillon (en %) qui, après 5, 15 et 30 minutes inhibe 50 % de la luminescence des bactéries. Cette concentration est désignée par CE 50-t, avec t le temps de contact des bactéries avec l'échantillon. En plus des tests de toxicité aigüe (obligatoires), deux autres tests optionnels ont été réalisés. Un test de toxicité chronique réalisé selon la norme NF ISO 20666 (AFNOR, 2009) sur Brachionus calycifiorus. Ce test consiste à mettre de jeunes femelles Brachionus

calycifiorus (âgées de moins de 2 h) en contact avec une gamme de concentrations d’éluats de

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la population par comparaison avec une population témoin. La concentration d’éluat inhibant 20 % de la croissance de la population est déterminée (CE20%).

Figure 3.33 : Logigramme du protocole H14 visant à évaluer l’écotoxicité des sédiments (MEEDM, 2009)

Enfin, un test de toxicité aigüe vis-à-vis des organismes terrestres a été réalisé selon la norme NF EN ISO 11269-2 (AFNOR, 2013) sur l’avoine (Avena sativa) et sur la navette (Brassica

rapa). Ce test vise à déterminer le taux de germination au bout de 7 jours et la production de

biomasse des plantes minimum 14 jours et maximum 21 jours après que 50 % des semis témoins aient germé. Ces mesures sont réalisées sur un sol témoin (carbone organique < 1.5

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% MS, terre fine < 20 % et 5 ≤ pH ≤ 7.5) et sur une gamme de dilution du sédiment (ou du sol) testé dans le sol témoin.