par la méthode de KJELDAHL

a. principe

L'attaque des composés contenant de l'azote aminé par H2S04 concentré en présence d'un catalyseur approprié, dont le rôle est d'élever le point d'ébullition de l'acide, permet de transformer intégralement l'azote en( NH4) 2:::04

On entraine l'azote ammoniacal formé par action d'une lessive alcaline par distillation; NH3 est recueilli qualitativement dans une solution aqueuse d'acide borique. En fin de distillation, on dose la solution borique ammoniacale par une solution d'acide chlorhydrique titrée.

b. réactifs

- acide sulfurique concentré -soude à 40% (plv)

-catalyseur: sélénium amorphe (lg), CuS04 anhydre (lg) et NazSJ4 anhydre (SOg)

-solution saturée d'acide borique (environ 4% (plv) - indicateur coloré: mélange de 0,12Sg de rouge de méthyle et de 0,083g de ble':l,de méthylène dans lOOml d'éthanol à95%.

- solution titrée d'acide sulfurique NISO

c. mode opératoire

On ajoute à 250mg de poudre à analyser, 300mg de catalyseur puis 3ml d'acide sulfurique concentré. On porte les matras préparés en double, à ébullition sur la rampe d'attaque jusqu'à clarification du liquide, la couleur finale étant bleu-verdâtre. En fin de minéralisation tout l'azote combiné est transformé en sulfate d'ammonium. Le contenu des matras refroidis est transvasé dans l'appareil à distiller et rincé 3 fois par 2ml d'H20 distillée. On introduit alors 15 ml de lessive de soude, en évitant toute fuite de vapeur. La distillation est poursuivie jusqu'à obtenir un volume distillé triple du volume initial de l'acide borique. L'ammoniac ainsi piégé est dosé par HCl N/50; le poids d'azote en g pour 100g de poudre sèche P est exprimé par: (n x 0,28 xlOO)/P x 100/100-H) avec:

n =nombre de ml d'HCl utilisé, 1ml d'acide N/50 correspond à 0,28mg d'N.

H= Humidité en poids. La teneur en protéines totale est calculée à partir de la teneur en azote totale multipliée par le facteur 6,25, en admettent qu'il y a environ 16g d'azote par lOOg de protéines.

XIV .3.2. Par analyse élémentaire

Ce dosage à l'avantage d'être plus précis et va nous permettre de calculer le nombre de -COOH libre puisqu'à côté de la teneur en azote, on obtient également la teneur en carbone.

Le calcul suivânt permet d'obtenir directement le pourcentage

,..

de -COOH totale à partir des résultats de l'analyse élémentaires.

C2HS

XV.Rétention des cations par les pulpes.

XV.l. Rétention des ions calcium

Le calcium est apporté au milieu sous forme d'acétate de calcium O,OSM à pH 7 ,1. Le pHstat est réglée au pH de la solution d'acétate (7,1). Les pulpes doivent être lavées à l'eau distillée avant d'être mises en contact avec la solution d'acétate de calcium. La neutralisation des ions H+ est suivie au pHstat (pH7,1), par neutralisation avec une solution de NaOH O,OSM pendant 6 minutes.

XV.2. Rétention des ions cuivre.

lg de pulpes sont mises dans 20ml d'eau. Le pH est ajustée au pH de la solution de CuClz(pH 5) en présence de CuClz 0,04M en large excès (75ml). on suit au pHstat (pHS) pendant 24 heures, la libération des ions H+

par neutralisation avec une solution de KOH titrée.

XVI. Détermination de la capacité d'échange des cations des pulpes

On considère en effet le plus souvent que les sites d'échanges sont les -COOH non estérifiés des pectines. La méthode développée ici permet en effet de déterminer la fJ.Xation du cuivre avant puis après saponification des pectines estérifiées. Le protocole utilisé est le suivant:

, ?

. - - - _.---iECHANTILLON

(Z:~:~ages

3 décrochages du cuivre fixé par 20 ml d'HCI 0,6M d'isopropanol à70%

Saponification: 20ml de NaOH 0,1 M dans isopropanol à 70%

Neutralisation: 20ml d'HOAc 1 M dans isopropanol à 70%

Figure 18 : Protocole du détermination du cuivre avant et après saponification des pectines doucement, mais en continu. Les conditions expérimentales sont les suivantes:

- éthanol à 66% dans l'eau puis seconde extraction à dosage des fibres

/~

Figure 19: Schéma du protocole d'extraction des lipides et des analyses

. /

ultérieures des pulpes.

*:Dans tous les cas les échantillons de pulpes sont séchés à l'air de manière à éliminer correctement l'éthanol. Ces échantillons secs sont analysés directement, soit congelés afin d'éviter toute altération des lipides avant les analyses finales.

Sur la fraction alcoolique, on détermine la matière sèche totale afin de connaître la perte de poids qu'entraîne la délipidation. De plus après avoir éliminé l'éthanol de cette fraction nous avons déterminé d'une part la teneur en sucres totaux extraits ( méthode colorimétrique de DUBOIS et d'autre part, après extraction à l'éther de petrole, la teneur en lipides extraits.

XVIII. Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse

XVIII.l. Principe

Comme la plus part des produits polaires, les acides gras ne supportent pas le choc thermique de l'injection sans dénaturation. Il est nécessaire de bloquer le groupement COOH. Ce blocage se fera ici par l'obtention de l'ester méthylique de cet acide gras. En fait dans le mode opératoire choisi ici, les triglycérides subissent directement une trans-estérification par le méthanol en milieu basique anhydre. Les esters méthyliques d'acides gras obtenus seront chromatographiés. La réaction de méthylation est la suivante:

CH2-0-CO-R 1 R1-COOCH3

1 1

---411.._.,.

+

CH2-0-CO-R3

R3-COOCH3

+ +

glycérol

Le carbonate de potassium permet le relargage des esters méthylique formés Cette estérification est effectuée à chaud et à reflux dans un bain thermostaté à 7SOC pendant 30min.

XVIII.2. Matériels

Colonne: Silar-10CPT10% sur Gaschrom QH, 100/120 mesh (L=3m, diamètre 2mm).

Le silar est une combinaison de phényl et de cyanoalkylpolysiloxanes (Alltech)

Conditions:

-azote= 1,4bar hydrogène=1,0bar air=1,0bar -atténuation: de 16 à 128

- sensibilité: 10 -10 A/mV - vitesse papier: 1 Omm/ min - injection: 23o·c

- détection: 23o·c

- programme: approximativement 150-190.C/min, puis

XVIII.3. Préparation des échantillons

- prélever lg d'échantillon dans un ballon rôdé de lOOml parfaitement sec

-ajouter lOml de KOH à 0,35% dans du méthanol sec (sur

cac12)

-placer le ballon dans un bain marie thermostaté à 75•c et adapter un réfrigérant à _{_,.} r:eflux. Laisser _.... à reflux pendant 30minutes.

-ajouter ensuite lOml de K2C03 à 5% et agiter, verser dans une ampoule à décanter de lOOml et ajouter lOml d'hexane. Recueillir cette phase dans un tube à vis de 18 ml. Prélever lf.l. de l'extrait hexane et injecter dans la colonne du chromatographe.

CHAPITRE I

FRACTIONNEMENT CHROMA TOGRAPHIQUE