Etude des fractions ultrafiltrées

Nous étudierons successivement le comportement d'un EP2 d'Eppeville et d'un EP2 danois ultrafiltrés lors d'une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Sepharose CL 6B (Pharmacia).

La manipulation est décrite dans le chapitre Matériel et Méthodes, cependant rappelons que la colonne de DEAE Sepharose CL 6B est équilibrée avec du tampon phosphate 0,05 M pH 4,8. Après chargement de la colonne, on élue les entités moléculaires non retenues avec ce même tampon, puis on augmente progressivement la force ionique du milieu en ajoutant au tampon du NaCl de façon à obtenir les concentrations de O,OSM, O,SM, lM et 2M en NaCl. A chaque fois on attend que les entités moléculaires libérées par l'augmentation de la force ionique soient éluées de la colonne avant de changer d'éluant de force ionique plus forte.

La détection des composés élués est réalisée par absorption à

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280nm. Le choix de cette longueur d'onde a été fait en fonction de l'absorption des impuretés contenues dans tous les cas des produits analysés.

De plus nous avons étudié deux autres paramètres notamment la concentration en sucres totaux et le pouvoir réducteur global des différentes fractions récupérées.

11.2.1. Etude des fractions de poids moléculaires supérieurs à 10000 daltons

Sur DEAE Sepharose CL 6B on obtient cinq fractions.

On remarque (figure 20 et 21) qu'il y a davantage de produits non retenus par la résine (avant l'addition de la première concentration en NaCl) pour l'EP2 danois que pour l'EP2 d'Eppeville. L'EP2 danois contient donc relativement plus de produits non chargés non retenus, qui sortent de l'EP2 d'Eppeville. Notons que dans les deux types d'échantillon la fraction éluée avec une concentration O,SM de NaCl est la plus colorée, les autres fractions sont relativement incolores ou peu colorées. Dans la littérature la formation de pigments bruns, est attribuée à des réactions chimiques entre sucres réducteurs (en particulier fructose et glucose) et les acides aminés qui sont toujours présents dans les solutions de sucres (Carruthers et col.

1963), (Schiweck et col. 1974) et (Reinefeld et col. 1971), on attribue aussi ces substances colorées à des polymères de condensation entre polysaccharides, protéines et phénols (Poel et col.1964).

En ce qui concerne le pouvoir réducteur des fractions éluées (Figure 20 et 21) avec le seul tampon phosphate, la fraction non chargée de l'EP2 d'Eppeville est nettement plus réductrice que la fraction non chargée de l'EP2 danois. Au contraire, dans l'EP2 danois ce sont les fractions les plus chargées et notamment celles éluées avec NaCl O,SM qui sont les plus réductrices.

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Figure :20: Chromatographie sur DEAE Sépbarose CL 68 du rétentat de poids moléculaire supérieur à IQQOO daltons de I'EP.2 d'Epœ\·ille Eluant Tampon phosphate pH 4.8 et O.OSM.

puis le même tarn oon est additionné de Na Cl 0.051yl. de Na Cl 05M. de Na Cl 1 M et en fin de

Figure ;,1: Chromatographie sur DEAE Sépharose CL 68 du rétentat de poids moléculaire supérieur à 19000 daltons de I'EP2 danois Eluant Tampon phosphate pH 4.8 et 0.05M. puis le même tamoon est additionné de NaCI 0.05M. de NaCI O.SM. de NaCI 1 Met en fin de NaCI

;!M. On suit l'absorption à 280nm la teneur en sucres totaux et enfin le pouvoir réducteur <DO à 700nm)

11.2.2. Etude des fractions de poids moléculaires comprises entre 2000 et 10000 daltons

Les figures 22 et 23 nous montrent qu'il existe assez. peu de différences entre les échantillons français et danois. Cependant, de la même manière que précédemment on note que les produits non retenus par la résine et qui sortent en tète sont là encore plus importants pour l'EP2 danois que pour l'EP2 d'Eppeville.

Les profils d'élution nous montrent cependant qu'un certain nombre de molécules de poids moléculaire compris entre 2000 et 10000 de l'EP2 danois sont plus chargées que celle de l'EP2 d'Eppeville. Il faut en effet une force ionique équivalente à lM de NaCl pour décrocher la totalité des produits déposés sur la colonne dans le cas de l'EP2 danois. En revanche une concentration de O,SM en NaCl suffit pour décrocher la presque totalité des produits chargés de l'EP2 d'Eppeville.

Enfin le dosage des sucres totaux contenus dans les différentes fractions issues de l'élution des EP2 danois et d'Eppeville n'ont pas montré de différences notables. On note cependant dans l'EP2 danois un pouvoir réducteur important dans la fraction non retenue, qui tend à s'atténuer dans les fractions suivantes O,OSM, O,SM et lM de NaCl avant de devenir très faible dans la dernière fraction éluée avec NaCl 2M. Ce résultat est nettement différent de celui obtenu avec la fraction de poids moléculaire supérieure à 10000 daltons pour laquelle nous avons observé l'inverse.

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11.2.3. Conclusion

La détermination sur chaque fraction de la teneur en oses totaux et du pouvoir réducteur a permis de montrer comparativement que la fraction de poids moléculaire supérieure à 10000 daltons de l'EP2 danois

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Figure 22: Chromatographie sur DEAE Sépharose CL 68 des produits de poids moléculaire compris entre 2000 et 10000 daltons de I'EP2 d'Eppeville Eluant: Tampon phosphate pH 4,8 et 0.05M. puis le même tampon est additionné de NaCI O.OSNf. de NaCI 0.5M. de NaCI lM et

Figure 23: Chromatographie sur DEAE Sépharose CL 68 des produits de poids moléculaire compris entre 2000 et 10000 daltons de I'EP2 danois Eluant Tampon phosphate pH 4.8 et 0.05M. puis le même tampon est additionné de NaCI 0.05M. de NaCI 0.5M. de NaCI lM et en fin de NaCI 2M. On suit l'absoœtion à 280nm la teneur en sucres totau:~: et enfin le pouvoir

réducteur (DO à 700nm)

contenait davantage de polyosides de caractère non chargé que la fraction correspondante de l'EP2 d'Eppeville ce qui implique inversement une teneur relative en polyosides chargés plus élevée pour l'EP2 d'Eppeville. En revanche pour la fraction de poids moléculaire comprise entre 2000 et 10000 les différences de composition des échantillons sont beaucoup moins marquées.

III. Comparaison entre ultrafiltration et dialyse pour la récuperation des