2-2) Origine et structure des NPB dans l’embryon de souris

Les origines du NPB présent dans l’embryon remontent à l’ovogenèse. Au cours de cette période, les ovogonies présentent un nucléole de type réticulé fibrillo-granulaire similaire à celui des cellules somatiques. Ce nucléole est fonctionnel, il y a transcription des gènes ribosomiques. Cependant, pendant la croissance ovocytaire, le nucléole va subir plusieurs modifications morphologiques (figure II-9) (Kyogoku et al. 2014). Ces modifications morphologiques se font en parallèle de la formation de l’antrum dans le follicule chez la souris (Chouinard 1971) et s’accompagnent de la réduction de l’activité transcriptionnelle (Oakberg 1968; Moore et al. 1974).

Figure II-8: Exemple d’un NPB dans l’embryon de souris au stade 4-cellules observé en microscopie électronique. Nucléole (NPB) fibrillaire sphérique. Un grain d'argent (pointe de flèche), correspondant à l'incorporation d'uridine tritiée dans les ARN ribosomiques nouvellement synthétisés, est visible près du centre fibrillaire qui se différencie à la périphérie du NPB. Modifiée à partir de Geuskens et Alexandre, 1984.

53 En effet, un agrégat dense composé de fibrilles empaquetées se développe progressivement au cours de la croissance de l’ovocyte, formant le NLB (nucleolus-like body). Le compartiment fibrillo-granulaire du nucléole entourant cet agrégat compact de fibrilles persiste au cours de cette croissance ovocytaire. Cependant, au stade GV, il finit par disparaître, aussi bien dans les ovocytes de type NSN que les SN. A la périphérie du NLB, mesurant environ 5µm de diamètre, se retrouvent quelques FC provenant du nucléole avant condensation. Il a été suggéré que ces FC correspondent aux NOR (Chouinard et al. 1971) et représentent les derniers sites actifs de transcription des gènes ribosomiques (Mirre and Stahl 1978). En effet, ces FCcontiennent un réseau de fibrilles d’ADN qui selon des études basées sur l’hybridation in situ (Knibiehler et al. 1977; Bonnet-Garnier et al. 2012) et la coloration à l’argent (Hernandez-Verdun et al. 1978) correspondent aux gènes ribosomiques.

Ce processus de compaction des nucléoles et sa relation avec la baisse de la transcription est commun à d’autres espèces. Il existe de nombreux travaux sur ce sujet chez le porc (Crozet et al. 1981). Une relation directe entre l’activité transcriptionnelle des gènes ribosomiques et la compaction du nucléole en masse fibrillaire dense a notamment été démontrée par Crozet et al. (1983). Alors que l'incorporation d'uridine tritiée dans les brins d'ARN néo-synthétisés diminue avec la condensation nucléolaire dans les ovocytes pré-antraux, l’utilisation d’actinomycine D, un inhibiteur de la transcription des gènes ribosomiques, entraîne une dé-

Figure II-9 : Modifications morphologiques du nucléole accompagnant la croissance ovocytaire. Les nucléoles dans les ovocytes de mammifères en croissance se composent de centres fibrillaires (rouge), de composants fibrillaires denses et de composants granulaires (points noirs). A la fin de la phase de croissance, les nucléoles sont inactivés et subissent des modifications morphologiques donnant un NPB. Modifiée à partir de Kyogoku et al. 2014.

54 granulation du nucléole suivie de sa compaction formant des NLB similaires à ceux observés dans le cas d’ovocytes au stade GV.

En fin de méiose, il y a alors rupture de la GV et le NLB disparaît. Son contenu est alors libéré dans le cytoplasme, attendant la fécondation. Après fécondation et formation des pronoyaux parentaux, ce matériel nucléolaire présent dans le nucléoplasme sert à la formation des NPB dans le zygote. L’importance du NLB d’origine maternelle dans la formation des NPB du zygote a été mise en évidence grâce à la technique d’énucléolation d’ovocyte au stade GV (Fulka and Langerova 2014) (figure II-10). Cette technique consiste en une microchirurgie au cours de laquelle le NLB est retiré de la GV de l’ovocyte. Il a ainsi été montré que : i) l’énucléolation n’empêche pas la progression de l’ovocyte vers la métaphase II ; ii) les embryons issus d’ovocytes ayant subi une énucléolation et fécondés artificiellement ne possèdent pas de NPB ; iii) ces embryons restent bloqués au stade 2-cellules. Ces données suggèrent que les NPB présents dans l’embryon sont d’origine maternelle et que ces NPB sont cruciaux pour le succès du développement embryonnaire.

En termes de structure, les observations réalisées en microscopie électronique montrent que le NPB est composé d’un réseau dense de fibrilles formant une masse fibrillaire compacte avec en périphérie des FC de forme convexe, constitués de fibrilles partiellement agrégées. Ces FC forment des protubérances de diamètre variant entre 0,5 et 1,5 µm (Takeuchi and Takeuchi 1986). L’une des caractéristiques du NPB est qu’il ne contient pas d’ADN (Fakan and Odartchenko 1980; Takeuchi and Takeuchi 1986; Baran et al. 1993; Biggiogera et al. 1994; Kopecny et al. 1995). Par contre, les NPB sont entourés de chromatine. Ainsi, après marquage nucléaire avec des colorants ADN, les observations en microscopie à fluorescence révèlent

Figure II-10: Effet de la manipulation artificielle des NLB et des facteurs associés aux NLBs sur le développement embryonnaire. Les embryons obtenus avec des ovocytes ayant subit préalablement une énucléolation au stade GV ne se développent pas au stade blastocyste. Modifiée à partir de Dang-Nguyen et Torres- Padilla. 2015

55 des structures apparaissant comme des « trous noirs » (les NPB) délimités par des anneaux fluorescents intenses (ADN agrégé à la périphérie des NPB). L’utilisation des techniques d’hybridation in situ en fluorescence a permis de montrer qu'il s'agit des séquences d’hétérochromatine péricentromérique ainsi que des séquences d'ADN ribosomique (figure II- 11) (Romanova et al. 2006; Maalouf et al. 2010; Probst et al. 2010; Salvaing et al. 2012; Aguirre-Lavin et al. 2012).

La formation des NPB dans l’embryon est aussi observée dans d’autres espèces de mammifères (Szollosi and Hunter 1973; Uehara and Yanagimachi 1977; Takeuchi and Takeuchi 1982; Naish et al. 1987; Tománek et al. 1989; Laurincik et al. 1995; Kanka et al. 1996). Toutefois la présence du NPB est transitoire au cours du développement, quelle que soit l'espèce. Ce NPB est systématiquement le siège de modifications morphologiques et structurelles qui ont lieu essentiellement au niveau de sa périphérie, aboutissant à la formation d’un nucléole de type somatique.

Figure II-11: Distribution de l’hétérochromatine péricentromérique (rouge) et des ADNr (vert) par FISH au stade 1-cellule, observée en microscopie confocale. La plupart des signaux d’ADNr sont autour des NPB. Toutefois, il existe parfois des signaux associés à des filaments d’hétérochromatine péricentromérique (partant des NPB vers la périphérie nucléaire) ainsi que des signaux de ADNr reliant deux NPB. Barre d’échelle:5 µm. Modifiée à partir d’Aguirre-Lavin et al. 2012.

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