Dans les protocoles qui vont suivre, l’ensemble des concentrations sont exprimées en valeurs initiales.
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I. Dosage enzymatique
De manière générale, la réaction a été initiée par le dépôt du substrat en dernier dans la microplaque, avant lecture. Le suivi cinétique se fait sur 30 min en enceinte thermo-régulée à 25 °C. Chaque point a été réalisé en trois réplicats (trois fois le blanc et trois fois l’échantillon). Un témoin négatif sans substrat a été réalisé pour chaque essai. Pour chaque substrat, la valeur moyenne de l’auto-oxydation (blanc) est calculée. Cette valeur est préalablement soustraite à la valeur des activités trouvées pour les échantillons. Les valeurs d’activité enzymatique présentées sont les moyennes ± écart type Cette procédure est commune à tous les tests enzymatiques réalisés par la suite.
1. Tests au dopachrome initial
Pour cette étude, les dosages enzymatiques ont été réalisé en microplaque 96 puits de chez Dominique Dutsher, France (stériles, PS transparent, fond plat, réf. 222-8030-01F). Ce test est basé sur le dosage mis en place par Le Bris C. et al. (2015).
a. Sans activateur
Dans une microplaque, 50 µl d’extrait enzymatique (EE) ont été déposés auxquels ont été ajoutés 50 µL de tampon Trishydroxyméthylaminométhane/acide chlorydrique (Tris/HCl) 100 mM pH 8,4. Après agitation pendant 10 min à température ambiante, la réaction a été initiée par l’ajout de 100 µL de solution aqueuse de substrat L-DOPA à 25 mM. La formation du dopachrome (Acide-5,6-dioxo-2,3-dihydro-1H-indole-2-carboxylique) a été suivie à 492 nm (Xenius, Safas Monaco), toutes les 1 min 30, pendant 30 min (21 points). En parallèle, le test a été réalisé sur le substrat hydroquinone à 40 mM (λHYDROQUINONEchrome = 390 nm).
Pour le contrôle de l’auto-oxydation du substrat, le tampon d’extraction (sodium phosphate 50 mM pH 7,2) a remplacé l’EE.
Remarque : Lorsque le dosage au dopachrome initial a été utilisé avec le substrat hydroquinone, le coefficient d’extinction molaire du produit coloré formé « Hydroquinone-chrome » n’était pas connu. Ainsi, les activités enzymatiques ont été données en unités relatives Abs.min-1. Pour comparer les activités obtenues avec les substrats L-DOPA et hydroquinone lors de l’utilsation de ce test, les activités ont donc été données dans cette même unité quelque soit le substrat utilisé.
b. Avec activateur
Le dodécylsulfate de sodium (SDS) a été utilisé comme activateur des protéines à activités POs. Il permet de faire la distinction entre les protéines actives naturellement et celles qui ne le sont pas. Il a été ajouté au tampon Tris/HCl à hauteur de 0,1 % (0,025 % final). Le principe du dosage reste identique à celui sans activateur.
2. Tests au dopachrome optimisé
Le test au dopachrome initial a été optimisé en augmentant la force tampon du milieu réactionnel. De la même façon, il permet de détecter la formation de l’intermédiaire réactionnel dopachrome [ɛ475nm = 3700 L.mol−1.cm−1, pH 5,6 (Mason H.S. 1948)]. Une unité
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d'activité PO a été définie ici comme la formation de 1 μmol.min-1 de dopachrome par les protéines à activités POs.
Dans une microplaque, 50 µl d’EE ont été déposés auxquels ont été ajoutés 50 µL de tampon NaP 350 mM pH 7,2 puis 50 µL d’eau distillée. La réaction a été initiée par le dépôt dans la microplaque de 50 µL de solution aqueuse de substrat à 10 mM, L-DOPA ou dopamine, deux substrats universels aux protéines à activités POs.
La formation du dopachrome a été suivie à 475 nm (SpectraMax i3, Molecular Devices, Royaume-Uni), toutes les 1 min, pendant 30 min (31 points).
Le contrôle de l’auto-oxydation du substrat a été déterminé en remplaçant l’EE par un EE dénaturé pendant 15 min à 95 °C au bain sec. Il a été ensuite centrifugé pendant 5 min à 16 000 g pour séparer les particules solides de la phase liquide, puis refroidie à température ambiante avant ajout dans le milieu.
3. Test au MBTH
Ce dosage s’inspire de la méthode décrite par Winder A.J. and Harris H. (1991).
50 µl d’EE ont été déposés dans la microplaque auxquels ont été ajoutés 50 µL de tampon NaP 350 mM pH 7,2 contenant 8 % de N,N-Diméthylformamide (DMF). 50 µL de solution aqueuse de 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate (MBTH) à 24 mM ont été mélangés au reste. La réaction a été initiée par le dépôt dans la microplaque de 50 µL de solution aqueuse de substrat à 10 mM, L-DOPA ou dopamine.
Dans ces conditions, la dopaquinone se lie au MBTH par addition de Michael pour former un composé coloré rose [ɛ505 nm = 29000 L.mol−1.cm−1, pH 6,9 (Winder A.J. and Harris H. 1991), Figure 33]. La formation du pigment a été suivie au spectrophotomètre à 505 nm, toutes les 1 min, pendant 30 min (31 points). Une unité d'activité PO a été définie comme la formation de 1 μmol.min-1
de pigment rose obtenu à partir de l'addition de Mickael entre le MBTH et la quinone produite à partir de l'oxydation du substrat phénolique.
Comme précédemment, le contrôle de l’auto-oxydation du substrat a été déterminé en remplaçant l’EE par un EE dénaturé pendant 15 min à 90 °C au bain sec. Il a été ensuite centrifugé pendant 5 min à 16000 g pour éviter de prélever les particules solides. Puis, il est refroidi à température ambiante avant ajout dans le milieu.
II. Calcul des activités enzymatiques volumique et spécifique
L’activité enzymatique volumique a été calculée seulement sur la partie linéaire de la courbe. Cette durée doit être commune aux trois réplicats. Par contre, les blancs ont été intégrés sur les 30 min de par leur très faible pente, pour traduire une allure générale.
Les valeurs d’absorbance ont été mesurées par le spectrophotomètre. Deux possibilités pour récupérer les valeurs de variation d’absorbance au cours du temps Δ Absorbance/dt :
- Soit Δ Abs/dt a été donnée directement par le logiciel du spectrophotomètre ;
- Soit Δ Abs/dt a été calculée à partir des données brutes grâce à la fonction droitereg du logiciel Excel.
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Pour le test au dopachrome initial, les activités sont données en unités relatives Abs.min-1 par mL d’extrait enzymatique ou par mg de protéines totales (coefficient d’extinction molaire du composé « Hydroquinone-chrome » non connu).
Pour le test au dopachrome optimisé ainsi que le test au MBTH, les activités sont données en unités du système international UI par mL d’extrait enzymatique ou par mg de protéines totales.
Visuellement, il y a détection d’une activité lorsque la courbe de l’échantillon est plus pentue que celle des blancs. Ceci est ensuite vérifié par le calcul, lorsqu’après déduction de l’auto-oxydation, la variation d’absorbance des échantillons reste positive.
III. Validation des tests et LOD
Pour valider les deux tests optimisés dans cette étude, test au dopachrome et test au MBTH, les limites de détection (LOD) ont été calculées selon les critères de l’Union internationale de chimie pure et appliquée (IUPAC). Pour cela, les gammes dynamiques respectives [Activité détectées = f(actitvité théorique)] ont été réalisées en faisant varier la concentration en protéines à activités POs alors que la concentration en substrat a été fixée à 10 mM. Les activités théoriques ont été calculées à partir d’une concentration en protéines à activités POs permettant d’obtenir une activté de 1 mU.puits-1
.
Dans un premier temps, les gammes ont été réalisées sur une laccase et une tyrosinase commerciales du champignon Agaricus bisporus (Sigma Aldrich).