I. Purification par chromatographie des protéines à activités POs
Les premières étapes d’optimisation de la purification ont été entièrement réalisées sur des échantillons sulfités. La seconde étape d’optimisation a été faite sur les crevettes non sulfitées.
1. Matériels
Les essais de purification des phénoloxydases ont été réalisés sur la phase Phenyl SepharoseTM CL-4B à interactions hydrophobes (HIC) et à l’aide du collecteur de fraction Äktaprime Plus 2.02 (General Electric Company, GE Healthcare Europe GmbH Life Sciences, Allemagne). La détection a été effectuée par le dosage de Bradford.
Lorsque les essais ont été réalisés à Lille 1, un Äktapurifier (GE Healthcare) a été utilisé. La détection des protéines a été retranscrite sur PC via le logiciel Unicorn (GE Healthcare).
2. Méthodes
Le protocole utilisé a été adapté à partir de la méthode décrite par Rolle R.S. et al. (1990) et Chen J.S. et al. (1997) qui ont travaillé avec ce type de phase pour purifier les phénoloxydases de crevettes dont celles de P. monodon. La purification a été réalisée à une température moyenne de 14 ± 3 °C en effectuant un gradient d’élution par étape (Tableau 16). Une vérification de la stabilité de l’activité enzymatique durant le temps de l’étape de purification à la température en cours a été réalisée en parallèle.
Tableau 16 : Méthode de purification et gradient d’élution pour la chromatographie à interactions hydrophobes (HIC). Volume « breakpoint » (ml) Eau distillée (%) Tampon d’élution (%) Echantillon (%) Ethylène Glycol (%) 0 0 0 100 0 0,1 0 0 100 0 15 0 0 100 0 15,1 0 100 0 0 29 0 100 0 0 29,1 50 50 0 0 53 50 50 0 0 53,1 90 10 0 0 78 90 10 0 0 78,1 50 0 0 50 89 50 0 0 50 89,1 100 0 0 0 249 100 0 0 0
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II. Dessalage
Lorsque cela le nécessite, l’échantillon est dessalé soit sur cellule d’ultrafiltration, soit par dialyse.
1. Cellule d’ultrafiltration
L’échantillon à dessaler a été déposé dans une cellule d’ulftrafiltration de type Amicon 10 kDa (Merck Millipore, Etats-Unis). La cellule a été centrifugée à 4 °C à la vitesse de 8500 g, pendant 45 min voire 1 h selon le volume déposé. La centrifugation a été jugée efficace lorsque le volume du retentât restant était compris entre 0,5 et 1,5 mL. Ce concentrât a ensuite été récupéré, et dilué de façon à obtenir la concentration en protéines voulue. La dilution est faite selon le besoin dans du tampon d’équilibration (purification) ou du tampon d’extraction (dosage enzymatique).
2. Dialyse
Pour dessaler l’échantillon, celui-ci a été déposé dans une membrane de dialyse de 12-14 kDa (Medicell International, Royaume-Uni) préalablement humidifié avec le tampon de dialyse sodium phosphate 50 mM ph 7,2. La membrane a été déposée dans un seau de 2 L à 4 °C, sous agitaiton, pour diayse contre le tampon pendant une nuit.
En vue du passage sur RP-HPLC-Q/TOF, l’extrait dilaysé a été récupéré et surgelé à – 80°C pendant 24h. La lyophilisation et ensuite réalisée pendan 24 à 48 h selon le volume de l’échantillon.
III. Electrophorèse
Pour l’identification des protéines à activités POs, l’électrophorèse a été réalisée sur gel précoulé de polyacrylamide/bisacrylamide de type « mini protean TGX (Tris-Glycine eXtended shelf life) precast gels », en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Les gels ainsi que les gel-boxes utilisés proviennent de chez Bio-Rad (France).
Les caractéristiques du gel de séparation sont :
- Concentration totale en acrylamide et bisacrylamide (T) : 10 % - Concentration en bisacrylamide réticulant (C) : 2,6 %
Les caractéristiques du gel de concentration sont :
- Concentration totale en acrylamide et bisacrylamide (T) : 4 % - Concentration en bisacrylamide réticulant (C) : 2,6 %
Les différents tampons et solutions utilisés sont : - Le tampon d’électrophorèse :
Tampon Tris à 0,125 mol/L pH 8,3 (solution stock 5X pour 10 « runs ») Tris-Base 15g + glycine 72g + SDS 5g q.s.p. 1L d’eau distillée.
- Le tampon de charge (40 mL) : 5 mL Tris/HCl pH 6,8
+ 23 mL glycérol + 8 mL SDS 10%
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+ 2 mL bleu de bromophénol à 1% ou une pointe de spatule
- La solution de coloration : 2.5 g de bleu de Coomassie 455 mL de méthanol ou ethanol 455 mL d’eau distillée
90 mL d’acide acétique (permet la fixation des protéines) - La solution de décoloration :
Cette solution contient les mêmes éléments que la solution de coloration, sans bleu de Coomassie.
La préparation des échantillons a consisté à mélanger 50 µL d’échantillon avec 50µL de tampon de charge puis le mélange a été chauffé pendant 5 min à 100 °C.
La migration a été réalisée de la manière suivante : - Tension : 300 V constante
- Courant de démarrage (par gel) : 55-75 mA pendant 15-20 min - Courant final (par gel) : 45-70 mA
IV. Identification peptidique par spectrométrie de masse
RP-HPLC-Q/TOF
Afin de pouvoir identifier les peptides contenus dans les fractions issues de la séparation sur HIC, une injection a été réalisée sur chromatographie liquide à haute performance en phase inverse couplée à la spectrométrie à quadripôle et temps de vol (RP-HPLC-Q/TOF).
Au préalable, une injection sur spectromètre de masse de type désorption-ionisation laser assistée par matrice et temps de vol (MALDI-TOF : Matrix-assisted laser desorption-ionization and time-of-flight) a été réalisée pour vérification de la bonne digestion des protéines.
1. Spectromètre de masse MALDI-TOF
Le spectrophotomètre est un autoflexl™ Speed MALDI TOF/TOF (Bruker, Massachusetts) utilisé en mode réflectron pour l'empreinte de masse peptidique MALDI-TOF (PMF). Les mesures de masse moléculaire ont été réalisées en mode automatique à l'aide du logiciel FlexControl™ 3.4.
a. Préparation des échantillons
Avant injection sur MALDI-TOF, les échantillons issus de fractions nécessitent une série de prétraitements. Dans ce cas, la technique de la « carte peptidique » ou PMF (Peptide Masse Fingerprint) est utilisée. Elle consiste à réaliser une digestion enzymatique (protéases) permettant de récupérer les peptides qui seront ensuite mesurés.
Les échantillons lyophilisés sont repris à 20 mg.mL-1 dans un tampon bicarbonate d’ammonium à 50 mM. 200 µg ou 20 µg sont alors soumis à une réduction/alkylation et digestion trypsique des protéines pendant une nuit. 10 µg de BSA (protéine témoin) subissent le même protocole. Une analyse est également réalisée sur 20 µg de deux autres protéines
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témoins : la laccase et la tyrosinase (Agaricus bisporus). Ces analyses permettent de vérifier si cette stratégie est valide pour l’identification de ces protéines (notamment concernant l’utilisation de la trypsine).
b. Injection sur MALDI-TOF
Les extraits ont été mélangés à la matrice constituée par l’acide -cyano-4-hydroxy-cinnamique (2,8 mg.mL-1 dans l'acétonitrile : TFA, 85 : 0,1 v / v). L’étalonnage externe sur la gamme de masse 1000-3500 a été réalisé en utilisant les ions monoisotopiques [M + H] + de la bradykinine 1-7, l'angiotensine I, l'angiotensine II, la substance P, la bombésine et l'hormone adrénocorticotrope (clips 1-17 et clips 18-39) à partir d'un kit standard d'étalonnage des peptides (Bruker Daltonik, Allemagne). Chaque spectre a été produit à partir des données provenant de 1 200 coups de laser.
2. Chromatographie RP-HPLC-Q/TOF
La chromatographie est un système ACQUITY UPLC (Waters Corporation, Massachusetts) utilisant une colonne Kinetex 2,6 μ C18 100A (150 x 4,6 mm) (Phenomenex, Californie). La source d'ionisation s’effectue par l’électrospray du qTOF Synapt G2-Si ™ (Waters Corporation).
10 µL sont injectés sur la chromatographie RP-HPLC-Q/TOF et élués selon le gradient
d'acétonitrile de 5 % à 15 % de solvant B en 30 min, de 15 % à 30 % en 60 min, de 30 % à 50 % en 10 min puis 10 min à 95 % de solvant B. Le débit était de 0,5 ml.min-1. Les phases mobiles étaient constituées par le solvant A (0,1 % d'acide formique / 99,9 % d'eau (v / v)) et le solvant B (0,1 % d'acide formique / 99,9 % d'acétonitrile (v / v)).
L'analyse MS a été réalisée en mode sensibilité, ion positif et analyse dépendant des données (DDA). La température de la source était de 150 °C et les tensions capillaires et coniques ont été réglées à 3 000 et 60 V. Les données MS ont été recueillies pour des valeurs m/z de l'ordre de 100 Da et 2000 Da avec un temps de balayage de 0,2 s. Un maximum de 15 ions précurseurs a été choisi pour l'analyse MS/MS avec un seuil d'intensité de 100 000. Les données MS/MS ont été recueillies avec un mode de fragmentation CID et un temps de balayage de 0,1 s.
L’identification des peptides obtenus se fait à l’aide du logiciel PEAKS Studio 7.0 (Bioinformatics Solutions). Les données sont ainsi confrontées à la banque de données Swiss-Prot restreinte aux individus P. monodon pour les lyophilisats ou Bos Taurus pour la BSA. Une tolérance de masse de 35 ppm et 3 sites de clivage manquants et une tolérance MS/MS de 0,2 Da ont été autorisées. L'oxydation variable de la méthionine et la carbamidométhylation fixe ont également été considérées. La pertinence des identités protéiques et peptidiques a été jugée en fonction de leur score dans le logiciel de recherche (valeur p de 0,05 (p < 0,05), taux de découverte faux < 1 %).