Optimisation des conditions expérimentales

3.3.2. Optimisation des conditions expérimentales

Dans le cadre de notre étude, nous avons conduit la réaction de pontage sur une solution de SAGA HAT d’environ 2 mg/mL (8 µM). Cette concentration d’échantillon est nécessaire pour une bonne détection en MALDI-MS et surtout une bonne détection de peptides pontés après digestion.

A la sortie de la purification et pour la conservation, le complexe SAGA HAT se trouve dans un tampon contenant 20 mM HEPES-KOH pH 8,0, 500 mM NaCl, 10% glycérol, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA. Même si le MALDI-MS est tolérant vis-à-vis des sels, il est important de limiter leur concentration au minimum afin d’assurer une bonne détection du signal de l’échantillon. A partir des études préliminaires sur la BSA en 3.2, nous avons vu qu’il y a possibilité de détecter un bon signal dans le tampon contenant 20mM HEPES pH 8,0 et 100 mM NaCl, compatible avec la conservation de l’intégrité de SAGA HAT selon nos collaborateurs.

Chapitre 3 : Etude par CX-MS de la stœchiométrie et de la topologie du complexe SAGA HAT

97 La Figure 13 présente des spectres MALDI-MS du complexe SAGA HAT ponté avec différentes options d’échange de tampon. Tout d’abord, dans le tampon d’origine, aucun signal n’est détecté (Figure 13A). Ceci peut être expliqué par la présence du glycérol, visqueux et faiblement volatil, qui perturbe la cristallisation de la matrice avec l’échantillon [17], et confirme la nécessité de réaliser un échange de tampon avant la détection en MALDI-MS. Ensuite, il est important de savoir quelle option d’échange de tampon (avant ou après pontage) permet une meilleure détection du complexe ponté :

- Avec un échange de tampon seulement après pontage, nous n’observons aucun signal (Figure 13B). Notre hypothèse est que le glycérol serait « emprisonné » dans le complexe ponté et ne pourrait plus être éliminé correctement lors de l’échange de tampon. Il serait intéressant de conduire des études plus approfondies pour vérifier si ceci se reproduit sur d’autres systèmes biologiques.

- Un échange de tampon avant pontage permet une bonne détection du signal du complexe ponté grâce à une bonne élimination du glycérol et des sels (Figure 13C). - Enfin, un échange de tampon avant et après pontage n’améliore pas le signal (Figure

13D), probablement car le gain dû à l’élimination du sel résiduel est contrecarré par la perte de l’échantillon lors de l’échange.

Ces résultats nous ont conduits à choisir un échange de tampon avant pontage.

Figure 13. Spectres MALDI-MS du complexe SAGA HAT ponté avec différentes options d’échange de tampon dans 20mM HEPES pH 8,0 + 100 mM NaCl (matrice SA, dépôt goutte séchée). (A) Sans échange de tampon, (B) Echange de tampon après pontage, (C) Echange de tampon avant pontage,

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98 Afin d’avoir un bon rendement de pontage en évitant des agrégations non-spécifiques, une optimisation des conditions de réaction est également indispensable.

Nous avons testé le pontage avec le BS3 aux différents ratios molaires protéine/BS3 (1:50, 1:75, 1:200) et aux différents temps de réaction (30 min, 2 h). La Figure 14 montre les spectres obtenus pour un temps de réaction de 30 min. Au ratio 1 : 50, des pics correspondants aux sous-unités libres sont encore observés. Au ratio 1 : 75, nous ne détectons plus de sous-sous-unités mais seulement des pics liés au complexe ponté. Au ratio 1 : 200, le grand excès d’agent de pontage induit beaucoup d’hétérogénéités dans les espèces pontées menant à un élargissement des pics du complexe et une diminution de l’intensité.

Ainsi, nous avons sélectionné les conditions de pontage du SAGA HAT avec le BS3 à un ratio protéine/BS3 1 : 75 (ce qui est équivalent à un ratio molaire de lysine/BS3 de 1:0,5 car SAGA HAT contient 164 lysines en tout) et un temps de réaction de 30 min à température ambiante. Ceci est en accord avec les conditions de réaction typiquement observées pour le pontage avec les agents de type ester NHS (concentration de protéine de l’ordre de la micromolaire, 20 à 1000 fois en excès d’agents de pontage, temps de réaction d’environ 30 min à température ambiante ou 2 h dans la glace [18]). La réaction de pontage est arrêtée avec une solution de Tris à 25mM dans le volume final.

Figure 14. Spectres MALDI-MS du SAGA HAT ponté avec différents ratios protéine/BS3 et un temps de réaction de 30 min (matrice SA, dépôt goutte séchée). (A) Protéine/BS3 1 : 50, (B) Protéine/BS3 1 : 75, (C) Protéine/BS3 1 : 200. De ces résultats, les conditions optimales de pontage ont été fixées

à un ratio 1 : 75 [19].

Enfin, comme toute étude par MALDI-MS, la puissance du laser et le nombre de tirs ont également été optimisés afin d’arriver à un bon compromis entre l’intensité du signal et la largeur des pics observés. Dans notre cas, le meilleur signal est obtenu avec une puissance laser de 53% et une accumulation de 3000 tirs.

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99 Après le pontage, une digestion tryptique en solution a été réalisée pour générer des produits pontés. Là encore, la quantité de trypsine et le temps de digestion ont été optimisés ; sont retenus un ratio d’enzyme/protéine de 1 : 5 et une incubation à 37°C pendant 3h.

Après digestion, l’échantillon est analysé en nanoLC-MS/MS dans un spectromètre de masse LTQ Orbitrap Elite (Thermo Scientific) en mode positif couplé à un nanoRSLC U3000 (Thermo Scientific). 1 pmol de l’échantillon est injecté sur une pré-colonne (C18 Dionex Acclaim PepMap100, 75 µm i.d. x 2 cm, 3 µm, 100 Å) avec H2O/ACN/acide formique (98/2/0,1) à 5 μL/min pendant 3,5 minutes. Ensuite, la séparation chromatographique a lieu sur une colonne C18 (Thermo Scientific Accucore, 75 µm i.d. x 50 cm, 2.6 µm, 150 Å) à 40°C avec 0,1% acide formique dans l’eau (phase mobile A) et 0,08% acide formique dans 80% ACN (phase mobile B). Le gradient dure 150 min (5 à 50% en phase B pendant 120 min, 50 à 99% en phase B pendant 1 min, 99% en phase B pendant 10 min, 99 à 5% en phase B pendant 1 min, 5% en phase B pendant 18 min) avec un débit de 200 nL/min. Puis les peptides sont analysés sur l’Orbitrap Elite en fragmentation HCD. L’accumulation des ions a été fixée à 100 ms et 4 x 104 ions. Les précurseurs de charge +1 sont exclus. La fenêtre d’isolation des ions précurseurs a été fixée à 2 Da, l’énergie de collision HCD à 30% pour la fragmentation. Le spectromètre de masse fonctionne en mode « full scan » dans la gamme de 300–1200 m/z avec une résolution de 240 000 à 400 m/z, puis les quinze ions les plus abondants sont soumis à l’analyse MS/MS dans l’orbitrap avec une résolution de 15 000. Les peptides sélectionnés pour la MS/MS sont exclus pendant 30 s. Enfin, les données brutes de masse sont converties en format MGF et MZML par le logiciel Proteome Discoverer™ (Thermo Scientific, version 1.4) pour l’identification.