Mise au point de l’étude des complexes RAR-RXR-ADN par ESI-MS

4.2.1. Difficultés de l’étude des complexes de type protéine-ADN

Bien que plusieurs études sur des complexes non-covalents par ESI-MS soient reportées, celles concernant des interactions de type protéine-ADN sont encore peu nombreuses [9–12]. Ceci pourrait s’expliquer par la grande polarité et la nature polyanionique de l’ADN. Les groupements phosphates tendent à se lier de manière non-spécifique aux cations alcalins présents dans le milieu [11] ; les adduits de sodium ou potassium alors formés persistent après l’ionisation et la désolvatation, ce qui a pour résultat l’élargissement du signal, rendant la mesure des masses et la détermination de la stœchiométrie plus difficiles [13]. Par conséquent, la préparation d’échantillon demande beaucoup d’attention.

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143 En amont de l’analyse en ESI-MS, un échange de tampon est réalisé afin de transférer l’échantillon dans un solvant volatil compatible avec l’ionisation électrospray et capable de maintenir les interactions non-covalentes. Dans le cas de notre étude, nous avons utilisé un tampon d’acétate d’ammonium à 100 mM, pH 7,8. Les échanges ont donc été réalisés afin d’avoir des solutions mères de protéines et d’ADN dans ce tampon. Au début, ces échanges se sont avérés délicats à maîtriser du fait d’adduits restants qui élargissaient le signal sur le spectre de masse comme illustré en Figure 4. Les spectres de RAR seul et RXR seul (Figure 4A et Figure 4B) sont bien résolus ; néanmoins, le spectre des deux protéines incubées avec 1 équivalent d’ADN (Figure 4C) présente beaucoup d’adduits élargissant le signal et rendant la mesure des masses et la détermination de la stœchiométrie impossibles.

Figure 4. Spectres de masse de (A) RAR seul à 9µM, (B) RXR seul à 9µM, (C) RAR-RXR incubés avec 1 équivalent de RARβ2 DR5.

Après optimisations, l’utilisation des colonnes de filtration sur gel Micro Bio-Spin (Biorad) avec deux passages successifs pour l’ADN seul a été concluante dans le cas de notre étude : elle nous a permis de nous affranchir de ces adduits, ce qui a été indispensable pour une détermination précise des masses des espèces détectées (Figure 5).

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Figure 5. Spectres de masse des récepteurs rétinoïques RAR-RXR incubés avec 1,2 équivalent de

RARβ2 DR5 avec deux échanges de tampon successifs pour l’ADN seul.

D’autre part, la concentration d’échantillon lors de l’analyse doit être suffisante pour favoriser la formation des dimères de RAR-RXR et permettre de détecter le signal avec une bonne intensité, mais ne doit pas être trop importante pour éviter des associations non-spécifiques. Afin d’être non ambigu dans des cas de stœchiométries très hétérogènes, la concentration de protéine a été revue à la hausse par rapport à nos conditions initiales et a été fixée à 32 µM.

4.2.2. Optimisation des paramètres instrumentaux

Dans ce projet, les analyses MS ont été réalisées en mode positif sur un spectromètre de masse MicrOTOF (BrukerDaltonics). Les paramètres instrumentaux ont été optimisés afin de maintenir les complexes protéine-ADN intacts lors du passage en phase gazeuse et lors de la transmission dans l’interface du spectromètre de masse.

Tout d’abord, il est important d’avoir la pression du gaz de nébulisation et le débit du gaz de séchage adéquats, afin de stabiliser le spray et d’assurer une bonne désolvatation des ions. Dans le cas de notre étude, la pression du gaz de nébulisation a été fixée à 0,6 bar et le débit du gaz de séchage à 6 L/min.

D’autre part, dans l’interface du spectromètre de masse où les ions sont transférés de la source à l’analyseur, l’énergie interne des ions peut être suffisamment importante pour dissocier le complexe [14]. La tension d’accélération (Capillary Exit) est un paramètre particulièrement déterminant : cette différence de potentiel entre la sortie du capillaire en verre et le premier skimmer du micrOTOF induit un champ électrique dans l’interface accélérant les ions. Cette énergie cinétique acquise va accroître l’énergie interne des ions seuls ou encore solvatés. Ainsi, l’augmentation de cette tension permet d’améliorer leur transfert jusqu’à l’analyseur et la désolvatation des ions, mais elle peut induire la dissociation des interactions non-covalentes et

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145 donc la dissociation des complexes. Pour notre étude, nous avons fait varier cette tension de 100 V à 200 V, le meilleur signal étant obtenu pour une tension de 150 V.

Nous avons également adapté des paramètres de stockage (« pre-pulse storage time ») et de transmission (« transfer time ») pour mieux détecter des complexes protéine-ADN qui ont des rapports m/z plus élevés que les protéines libres. Avec un temps de transmission plus faible, on favorise la détection des formes de protéines libres, tandis qu’avec un temps de transmission plus élevé, on observe préférentiellement des formes complexées. La Figure 6 illustre cet effet discriminant auquel il faut faire attention pour pouvoir relier les signaux détectés sur les spectres de masse à l’abondance relative des espèces présentes. C’est un compromis entre une bonne détection des ions lourds et une meilleure représentativité des espèces présentes en solution. Dans le cas de notre étude, le « pre-pulse » a été fixé à 40 µs et le « transfer time » à 100 µs.

Figure 6. Spectres de masse des récepteurs rétinoïques RAR-RXR incubés avec 0,25 équivalent de

RARβ2 DR5. (A) Pre-pulse à 40µs, (B) Pre-pulse à 30µs.

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