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III. Traitement des échantillons au laboratoire

II.1. Observation des symptômes sur le terrain

Le verger dont on a fait l’échantillonnage montre la présence des symptômes caractéristiques de la maladie de la tuberculose sur différentes parties, ces symptômes se manifestent par la présence des tumeurs et des excroissances sur les différentes parties de l’olivier (figure n 19)

Figure n °19 : Symptômes de la tuberculose de l’olivier

II.2. Résultats du diagnostic au laboratoire :

A partir des échantillons prélevés dans le verger, nous avons pu isoler et purifier sur différents milieux de culture : milieu Levane, milieu King B et milieu LPGA 08 isolats bactériens Afin d’arriver à la caractérisation phénotypique des souches isolées à partir des tumeurs prélevés, le passage par les caractères macroscopiques a été indispensable.

Les souches, après une croissance de trois jours donnent des colonies à des caractères macroscopiques variés. La description des colonies est représentée dans le tableau n 05

Tableau n°05 : Description des colonies bactériennes obtenues sur différents milieux

Code de la colonie

Description sur milieu Levane

Description sur milieu King B

Description sur milieu LPGA

LPi(2)

-levane +

-bordure régulière, forme circulaire, élévation convexe, surface lisse, opacité brillant, une couleur blanc cassé. -production de muqueuse

-colonie de taille moyenne à grande, brillante et lisse, à élévation convexe

légèrement et une couleur crème plus ou moins fluorescente.

-production de muqueuse.

-

colonie de taille moyenne à bordure régulière avec une forme circulaire, une élévation bombée et une couleur blanc cassée. -production de muqueuse.

LPi(2)’

-levane +

-une colonie de couleur blanc cassé, forme circulaire, élévation convexe, surface lisse et une forme circulaire. -production de muqueuse.

-colonie de taille moyenne à grande, brillante et lisse, à élévation convexe et une couleur crème plus ou moins fluorescente à bord

translucide.

-production de muqueuse.

-

colonie de taille moyenne à bordure régulière avec une forme circulaire, une élévation convexe et une couleur blanc cassée. -production de muqueuse.

LPi(3)

-levane +

-une colonie de couleur blanche, forme circulaire, élévation convexe, surface lisse et une forme circulaire. -production de muqueuse.

-colonie moyenne à petit régulière, lisse à couleur beige fluoresçante et à élévation plate.

-absence de muqueuse.

-colonie de taille moyenne, régulière, circulaire et à élévation convexe et une couleur blanc cassé. -production de muqueuse.

LPi(4)

-levane +

-une colonie de couleur crème, forme circulaire, élévation bombée, surface lisse et une forme circulaire. -production de muqueuse.

-

colonie brillante de taille moyenne, lisse à élévation convexe et une couleur jaune opaque.

-production de muqueuse.

-

colonie brillante de taille moyenne, lisse à élévation bombée et une couleur jaune.

-production de muqueuse.

LVi(2)

-colonie de forme

filamenteuse, irrégulière à couleur blanc cassé. -absence de muqueuse.

Contaminée

-colonie de forme

filamenteuse, irrégulière à couleur blanc cassé, élévation bossue -absence de muqueuse

LVi(3)

-colonie de taille moyenne, régulière, forme circulaire et une élévation convexe, de couleur blanc jaunâtre. -production de muqueuse.

-Colonie de taille moyenne à petite, brillante et une

surface lisse. Une couleur jaune très claire avec une élévation plate.

-absence de muqueuse.

-colonie de taille moyenne, régulière, forme circulaire et une élévation convexe, de couleur crème.

-production de muqueuse en faible quantité.

LVi(3)’

-colonie de taille moyenne, régulière, forme circulaire et une élévation convexe, de couleur blanc cassé. -production de muqueuse.

-Colonie de taille moyenne à petite, brillante et une

surface lisse. Une couleur jaune translucide avec une élévation plate.

-production de muqueuse en petite quantité.

-colonie de taille moyenne, régulière, forme circulaire et une élévation convexe, de couleur blanc cassé.

-production de muqueuse en faible quantité

LVi(4)

-colonie de surface lisse, circulaire, régulière et une élévation légèrement bombée de couleur crème.

-production de muqueuse en petite quantité.

-colonie de petite taille, croissante lente, brillante à surface frisée. Une couleur plus ou moins fluorescente avec une élévation plate. -absence de muqueuse.

-colonie de surface lisse, circulaire, régulière et une élévation convexe de couleur jaune.

-production de muqueuse.

Les ensemencements des isolats sur les différents milieux (King B, Levane, LPGA) ont permis d’observer des colonies bactériennes présentant les caractéristiques morphologiques

des Pseudomonas citées dans la littérature (Botelho & Leda, 2006), ce qui est montré dans la figure n 20. La différence macroscopique observée entre quelques isolats peut revenir à la différence d’espèces

La majorité des souches obtenues sur milieu LPGA ont une couleur crème, forme circulaire, convexe, lisse, brillante à taille moyenne (figure 20) identique à celle décrite par (Bergey, 2003). On a observé presque les mêmes caractéristiques sur milieu King B avec la présence d’une légère fluorescence pour certains isolats.

King B LPGA

Levane

Figure n °20 : Résultat de purification des colonies bactériennes sur les trois milieux (King B , Levane, LPGA)

Par contre sur le milieu Levane on a obtenu la même description des colonies que celle de Guido M et al (2005), les colonies décrites sont de couleur blanc gris avec un aspect visqueux, forme circulaire, convexe, translucide (figure n 20).

II.3. Caractérisation biochimiques des isolats bactériens

Les résultats de la caractérisation biochimique des isoltats bactériens sont résumés dans le tableau n°06

Tableau n°06 : Résultats des tests biochimiques

II.3.1

Test oxydase :

Parmi les 8 isolats testés pour la réaction d’oxydase, 7 isolats se sont révélés oxydase négatif ce qui traduit l’absence de l’enzyme oxydase intracellulaire. Un seul isolat présente une réaction oxydase positif, il s’agit du la souche LPi(4). La réaction positive se traduit par l’apparition d’une coloration violacée sur le papier filtre. Un exemple de résultat est montré dans figure n 21.

Les 7 isolats bactériens oxydase négatif présentent la réaction typique de Pseudomonas

savastanoi selon les données bibliographiques rapportées par Boulssen et al (2016)

Test

code

Oxydase Gram(KOH) Catalase

Pectinase

Arginine

LPi(2)

-

+

+

-

-

LPi(2)’ -

+

+

-

-

LPi(3)

-

+

+

+

-

LPi(4)

+

-

+

-

-

LVi(2) -

-

+

-

-

LVi(3) -

-

+

-

-

LVi(3) ‘ -

-

+

-

-

LVi(4) -

-

+

-

-

(A) (B)

Figure n°21 : résultats de test oxydase (A) : test négatif, ,(B) : test positif

(B) II.3-2 Test péctinase

Un total de 7 isolats n’a pas montré la capacité à dégrader la pectine présente dans les rondelles de la pomme de terre, Ce résultat se concorde avec celui trouvé par Boulssen et al (2016). Selon Guide et al.,(2005) Pseudomonas savastanoi ne dégrade pas la péctine.

La seule souche qui s’est révélée pectinase positif est la LPi(3), Cette souche possède la pectinase, l’enzyme nécessaire pour dégrader la pectine de la pomme de terre (figure n 23).

Figure n°22 : Résultat de test péctinase figure n°23 : Résultat de test péctinase

Test négatif Test positif II.3.3. Test catalase :

Ce test est positif pour la totalité de nos isolats, une réaction positif se traduit par le dégagement du bulle d’aire (figure n 24) , c’est un résultat est identique à celui trouvé par Kirde et al, (2011). Ces auteurs rapportent que Pseudomonas savastanoi est capable de dégrader le H2O2 en eau et en oxygène.

Figure n°24 :Résultat de test catalase

II.3.4. Test de Gram :

Cinq isolats sur huit analysés forment un filament continu (figure 25) en présence de KOH à 3%, ce qui montre que ces souches sont gram négatif. Les autres isolats : LPi(2), LPi(2)’, LPi(3) sont gram positif.

II.3.5. Test arginine :

Comme c’est mentionné dans le tableau ci-dessus le test est complètement négatif pour les huit isolats, On n’a pas observé un changement de couleur, et d’après (Guido et al, 2005). les Pseudomonas savastanoi sont des arginine négatifs.

Témoin

Figure n°26 : Résultat de test arginine (test négatif)

Les essais effectués au laboratoire nous ont permis d’identifier les isolats les plus susceptibles d’être Pseudomonas savastaoi, il s’agit de LVi(2), LVi(3), LVi(3)’et LVi(4),

Ces résultats ne permettent pas de confirmer si ces bactéries sont phytopathogénes, car le test d’hypersensibilité sur les feuilles de tabac n’a pas été effectué. D‘autres tests plus précis peuvent être utilisé pour savoir si ces souches sont bien Pseudomonas savastanoi , on peut citer le test d’immunofluoercence, les test de biologie moléculaire (PCR)

D’un autre coté, les tumeurs formés sur l’arbre de l’olivier sont des niches idéales pour la croissance bactérienne non seulement de l’agent causal de la maladie (Pseudomonas

savastanoi pv.savastanoi), mais aussi d'un nombre de Gammaproteobacteria endophytes tels

que Erwiniatoletana, Pantoea agglomerans et d'autres bactéries des genres Burkholderia,

La wilaya de Bouira est parmi les régions les plus connues par la culture de l’olivier, comme toutes autres régions nationales et même internationales qui sont situées à proximité au bassin méditerranéen. Cette importance donnée à cette culture revient à son intérêt économique, thérapeutique et alimentaire.

Notre travail vise à étudier deux maladies microbiennes les plus redoutables de l’olivier dans cette région (la verticilliose et la tuberculose), cette étude a été effectuée dans une période bien déterminé (Mars à Mai 2018) dans la station d’Ath mansour.

Après la collecte de plusieurs échantillons présentant les symptômes des deux maladies de l’olivier l’arbre. Les tests effectués au laboratoire ont permis de :

- Identifier cinq genre fongiques sur les échantillons présentant les symptômes de la verticilliose, il s’agit d’Altenaria, Rhizoctonia, Stemphylium, Penicilium et Absidia.

- Conclure que les symptômes de dépérissement observés sur les échantillons analysés ne sont pas dus à la verticilliose, mais peuvent être dus à Rhizoctonia et à stemphylium.

- Identifier quatre isolats bactériens avec des caractéristiques biochimiques similaires à ceux de Pseudomonas savastanoi (LVi2, LVi3, LVi3’, LVi4)

Les résultats de ce travail nous ouvrent des voies de recherche intéressantes telles que: • L’élargissement des prospections dans d’autres oliveraies algériennes afin

d’évaluer leur état phytosanitaire et d’estimer les incidences économiques. • Améliorer les découvertes sur des techniques et des méthodes plus rapides et

plus exactes dans l’identification des bactéries et des champignons. • L’étude de l’interaction hôte / pathogène, pour mieux comprendre le mode

pathogénique des champignons et des bactéries.

• La recherche des mesures de lutte biologique ou autre afin de diminuer les dégâts dus à ces deux maladies.

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PDA déshydraté ……….42g Eau distilée………1l Milieu levane Nutrient agar………....23 g /l D-glucose………...2.5g/l Sucre de table………50g /l Eau distillée………....…1l

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