65 Chez les mammifères, la superfamille des récepteurs nucléaires joue un rôle déterminant dans la régulation et le bon fonctionnement de divers évènements physiologiques. Si la majorité d’entre eux sont régulés par leurs ligands naturels, d’autres sont dits orphelins car leurs ligands naturels ne sont pas encore connus à ce jour. Parmi ceux-ci, le récepteur aux hormones stéroïdiennes ERR (Estrogen-Related Receptor) est apparenté au récepteur des estrogènes ER (Estrogen Receptor). ERR régule la transcription de divers gènes impliqués dans le métabolisme énergétique cellulaire en se liant spécifiquement au niveau des promoteurs à la séquence consensus de type 5’-TNAAGGTCA-3’ formée d’un demi-site unique 5’-AGGTCA -3’ précédé par trois nucléotides 5’-TNA-3’. ERR est exprimé sous différentes isotypes α, β et γ dont les niveaux d’expression plus ou moins élevés sont associés à un mauvais pronostic oncologique. En effet, la surexpression d’ERRα est responsable du développement tumorigénique dans les cas les plus graves de cancer du sein et des ovaires alors que ERRγ est faiblement exprimé dans les tumeurs de la prostate ou de l’endomètre. Si ERR est orphelin, son activité peut cependant être régulée par la liaison de ligands synthétiques antagonistes. Toutefois, des comportements différents sont observés parmi ses isotypes quant à la fixation de ces ligands. En effet, l’antagoniste DES se lie à ERRγ et ERRα alors que le 4-OHT, une molécule largement prescrite dans le traitement du cancer du sein, ne se fixe pas sur ERRα à l’inverse des autres isotypes. Cette particularité d’ERRα et son rôle central dans la signalisation cellulaire du métabolisme font de lui une cible thérapeutique spécifique et pertinente afin de contrer la croissance des tumeurs cancéreuses. Étant donnée l’importante implication d’ERRα en santé publique et le grand intérêt dont cette protéine fait l’objet en tant que cible thérapeutique, j’ai choisi de consacrer ma thèse à la compréhension du comportement biochimique et moléculaire de ce récepteur nucléaire.
Le caractère orphelin d’ERR, la régulation de son activité encore incomprise aujourd’hui et son action dans la transcription génétique au sein des grandes voies métaboliques cellulaires soulignent l’individualité de cette protéine et font d’elle un objet d’étude d’autant plus attrayant. Étant donnée l’implication modulaire des différents domaines structuraux et la complexité de leurs mécanismes d’action, ce projet est divisé en trois principales sections à l’image des différents événements qui régissent l’activité d’ERR : dans un premier temps, la modulation de l’activité d’ERR par des ligands antagonistes, dans un deuxième temps, le mode d’interaction d’ERR avec ses séquences consensus spécifiques au niveau des promoteurs géniques et enfin une vue globale sur l’ensemble du récepteur pour comprendre l’implication de ses différents domaines modulaires dans son activité.
Le domaine de liaison aux ligands LBD (Ligand Binding Domain) joue un rôle majeur dans la régulation de l’activité d’ERR. Il représente la cible de protéines corégulatrices et de ligands (encore inconnus) qui ont un effet activateur ou répresseur sur l’activité transcriptionelle d’ERR selon le contexte cellulaire. L’activité constitutive de l’isotype α serait dû à sa poche de liaison aux ligands de seulement 100 Å3.La présence de la Phe328 sur l’hélice H3, correspondant chez ERRβ, ERRγ et les ERs à une alanine, encombrerait cette poche et serait ainsi responsable du caractère constitutif d’ERRα. De ce fait, la fixation d’un ligand antagoniste dans la poche induirait un réarrangement conformationnel conséquent de la Phe328 impliquant le déplacement important de la Phe510 située sur l’hélice H12. Cette dernière, ayant un comportement spatial très dynamique, peut adopter une conformation agoniste ou antagoniste. Dans le cas de la fixation d’un ligand antagoniste induisant le réarrangement des phénylalanines, l’hélice 12 se positionne en conformation antagoniste dans le sillon de liaison aux coactivateurs en réalisant des interactions hydrophobes évitant la liaison de coactivateurs (PDB 3K6P). Les mêmes interactions sont observées lorsqu’un peptide activateur est lié au LBD dans sa forme apo stabilisant l’hélice H12 en interagissant avec cette dernière (PDB 3D24). L’atténuation de l’activité constitutive d’ERRα représente alors l’événement à cibler à l’échelle moléculaire et constitue une stratégie de traitement pour les cancers ERRα-dépendants. Dans le cadre de mon projet, j’ai utilisé le ligand agoniste inverse XCT-790 ciblant spécifiquement ERRα. Des études in vivo de l’activité biologique d’ERRα en présence du XCT-790 ont montré que la liaison de ce dernier à ERRα conduit à une perturbation des interactions avec le motif canoniques LXXLL des protéines coactivatrices induisant une inhibition de 90 à 100% de l’activité constitutive d’ERRα. La prolifération cellulaire est alors ralentie dû au blocage du cycle cellulaire en
66 transition G1/S de façon ERRα-dépendante. D’autres caractéristiques ont été déterminées quant aux mécanismes d’antagonisme du LBD notamment grâce aux structures cristallographiques du LBD en complexe avec les composés 1a et 29 qui illustrent les événements moléculaires de l’inhibition de l’activité constitutive d’ERRα. Afin d’apporter une vision plus riche sur le concept d’antagonisme de l’activité d’ERRα, mon objectif était donc en partie orienté vers la compréhension des bases moléculaires qui régissent ce mécanisme d’inhibition en déterminant la structure tridimensionnelle à l’échelle moléculaire du complexe entre le LBD d’ERRα et le XCT-790 en présence de peptides corépresseurs issus de NCoR par cristallographie aux rayons-X. L’utilisation de corépresseurs s’appuie sur les structures cristallographiques déjà connues, notamment des LBD de RAR et PPAR, qui démontrent l’importance de leur participation dans la stabilisation du LBD en conformation agoniste. En parallèle, il est crucial de comprendre le comportement biochimique du LBD pour mener à bien la cristallisation du complexe. Ce dernier doit alors être biochimiquement et biophysiquement caractérisé. La mise en place du protocole de purification du LBD est nécessaire pour mener ensuite une étude de la stabilité et la stœchiométrie des complexes LBD/XCT-790 et LBD/XCT-790/peptides notamment par DLS (Dynamic-Light Scattering) ou par spectrométrie de masse en conditions natives. Les données structurales tirées de cette étude concernant les déterminants structuraux régissant les interactions LBD/ligand aideront au drug design de nouvelles molécules thérapeutiques permettant de cibler spécifiquement l’activité d’ERRα et ainsi de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Le domaine de liaison à l’ADN DBD (DNA Binding Domain) correspond au domaine d’interaction spécifique avec les séquences promotrices des gènes cibles. Ces interactions sont possibles grâce à la présence des deux motifs d’interactions à l’ADN structurés en doigt de zinc, très conservés entre récepteurs nucléaires. ERR se lie très spécifiquement à son élément de réponse de type 5’-TNAAGGTCA-3’ appelé demi-site étendu ERRE car il est formé d’un demi-site unique précédé par trois nucléotides. Si ERR est homodimérique du fait des fortes interactions inter-domaines de son LBD, la structure RMN du DBD de ERRβ suggère la liaison d’un seul DBD sur un unique demi-site étendu. La problématique soulevée est alors de comprendre le comportement spatial du second DBD. Dans le cadre de ce projet de thèse, l’un de mes objectifs est de comprendre à l’échelle moléculaire les interactions chimiques réalisées au niveau de cette interface protéo-nucléotidique et tout particulièrement de comprendre le comportement stœchiométrique des DBD sur un ERRE. Pour cela, j’ai travaillé avec le domaine isolé DBD d’ERRα comprenant la partie centrale, qui est constituée des deux structures en doigt de zinc, et de l’extension carboxy-terminale CTE connue pour renforcer l’ancrage du DBD sur un ERRE en interagissant avec le petit sillon de l’ADN. La première étape consiste en la mise en place du protocole de purification du DBD, suivie de la caractérisation de sa stabilité en complexe avec des oligonucléotides, par des techniques biochimiques et biophysiques afin d’envisager les tests de cristallisation. En parallèle, des expériences de spectrométrie de masse et de SAXS permettent de répondre à cette problématique de stœchiométrie adoptée par les DBD sur un ERRE.
Comment est dictée la topologie adoptée par ERR sur un ERRE suite à sa régulation par des ligands et des corégulateurs protéiques ? Pour répondre à cette question, il est judicieux de considérer les études des domaines isolés LBD et DBD et de les transposer à l’ensemble du récepteur pour permettre d’interpréter la communication inter-domaines et de comprendre comment un ligand à effet agoniste ou antagoniste peut agir en aval sur le mode d’interaction d’ERR à l’ADN. Cette partie du projet, concernant l’étude du comportement d’ERRα entier, représente un véritable challenge étant donné la complexité de fonctionnement du récepteur qui est notamment illustrée par la présence, dans ce cas, du domaine amino-terminal A/B prédit comme étant extrêmement dynamique rendant plus complexe l’étude biophysique et structurale du récepteur entier ERRα. Ainsi, pour s’inscrire dans la stratégie d’inhibition de son activité, mon projet s’oriente sur l’étude ambitieuse d’ERRα à l’état antagoniste en complexe ternaire avec un ERRE, le ligand inverse agoniste XCT-790 et des peptides corépresseurs NCoR par cristallographie aux rayons-X. Ceci implique l’étude physico-chimique de tels complexes, de l’optimisation du protocole de purification d’ERRα jusqu’à son étude structurale.
67 Cette étude de biologie structurale du récepteur nucléaire orphelin ERRα a donc pour objectif majeur de lever le voile sur les mécanismes moléculaires qui régissent l’activité de cette cible thérapeutique, depuis la régulation de son activité par les LBD jusqu’à son mode de liaison sur l’élément de réponse ERRE par les DBD pour l’initiation des événements pro-transcriptionnelles en aval. Ce projet s’organise donc autour d’une étude des domaines modulaires LBD et DBD isolés. D’une part, la fixation du ligand agoniste inverse XCT-790 sur le LBD permet de déterminer les mécanismes structuraux de l’antagonisme de ERRα, et d’autre part, l’étude du DBD permet de comprendre l’organisation qu’il adopte sur les séquences promotrices ERRE. La transposition des comportements de ces domaines isolés à l’ensemble du récepteur ERRα facilitera alors son étude fonctionnelle, afin de déterminer les communications inter-modulaires permettant d’assurer son rôle de régulateur de la transcription.
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