Étude du récepteur ERRα entier *****
2. Caractérisation de complexes ERRα/ERRE/peptide NCoR
2.3. Interaction ERRα/ADN : exemple du promoteur du gène trα comparé au gène rb1cc1
Pour déterminer l’affinité d’interaction au sein du complexe ERRα/ADN, des expériences de MST ont été réalisées afin d’évaluer la constante de dissociation Kd du complexe nucléoprotéique. Le gène trα, comprenant un ERRE, étant celui utilisé pour les tests de cristallisation, un oligonucléotide de 33 paires de bases de ce gène (33trα) a été utilisé. En parallèle, pour comparer les forces d’interaction en lien avec la spécificité d’ERR pour un élément de réponse, des mesures ont également été réalisées avec un IR3. Pour cela, un autre oligonucléotide de 33 paires de bases dérivé du gène rb1cc1 (33rb1cc1) a été utilisé. Ces oligonucléotides sont présentés dans le tableau 13.
Pour l’oligonucléotide 33trα, le comportement thermophorétique est enregistré en fonction du temps en secondes sur huit expériences. Les courbes correspondantes ont été normalisées et montrent un comportement reproductible, malgré la présence de quelques courbes bosselées qui n’ont pas été prises en considération (figure 70a). La fluorescence normalisée a été tracée en fonction de la concentration en oligonucléotide 33trα en nM. La courbe de liaison sigmoïdale obtenue a permis de déterminer un Kd d’une valeur d’environ 107 nM entre ERRα et l’oligonucléotide 33trα (figure 70b).
De la même manière, les études de l’interaction entre ERRα et l’oligonucléotide 33rb1cc1 ont été réalisées sur trois expériences (figure 71a). La normalisation des courbes de thermophorèse obtenues a permis d’obtenir une courbe sigmoïdale de liaison où la fraction liée est représentée en fonction de la concentration d’oligonucléotide 33rb1cc1en nM. Le Kd déterminé pour cet élément de réponse IR3 est d’environ 67 nM (figure 71b).
Pour conclure, le Kd de 107 nM caractérisant le complexe ERRα/33trα représente une interaction relativement forte, laissant présager un complexe suffisamment stable pour espérer le cristalliser. Étonnamment, l’affinité d’ERRα pour le IR3 in vitro (67 nM) est plus importante que pour l’ERRE. Il est à penser cependant que cette plus forte affinité se fait au détriment de la spécificité d’interaction
Nom de
l’oligonucleotide Gène Séquence
Elément de
réponse Expérience
33trα trα 5’- CGATTTGTCA3’- GCTAAACAGTTCCAGTGTGTCACTCAATGGCCG -5’ AGGTCACACAGTGAGTTACCGGC -3’ ERRE MST 33rb1cc1 rb1cc1 5’- TCCGCAAAGAAGGTCAAATTCACCTTGGGAAAG -3’
3’- AGGCGTTTCTTCCAGTTTAAGTGGAACCCTTTC -5’ IR3 MST
Tableau 13 : Oligonucléotides 33trα et 33rb1cc1 utilisés pour les expériences de MST
Les séquences nucléotidiques de 33 paires de bases sont indiquées et les éléments de réponse figurent en rouge. L’extension de trois nucléotides du ERRE est soulignée.
123
Figure 70 : Détermination de la constante de dissociation Kd caractérisant l’interaction entre ERRα et l’oligonucléotide 33trα. ERRα marqué est tenu à concentration constante et est titré en fonction de concentrations
croissantes de 33trα. a. Courbes de thermophorèse où la fluorescence normalisée sur neuf mesures est représentée en fonction du temps de mesure en secondes. Les données sont enregistrées à 24°C pour des puissances d’excitation et de laser-IR respectives de 30% et 20%. Le moment de thermophorèse pris en compte pour le tracé de la courbe de liaison sigmoïdale est représenté par les barres bleue et rose. Les courbes grisées correspondent aux mesures non significatives qui n’ont pas été prises en compte pour l’expérience. b. Sigmoïde de liaison permettant la détermination du Kd. Les barres d’erreur sur les neuf mesures sont représentées pour chaque point (χ² = 0,66 ; SER = 3,28). La concentration de 33trα varie de 0,76 µM à 25 µM pour une concentration constante d’ERRα marqué de 25 nM.
a.
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Figure 71 : Détermination de la constante de dissociation Kd caractérisant l’interaction entre ERRα et l’oligonucléotide 33rb1cc1. ERRα marqué est tenu à concentration constante et est titré en fonction de concentrations
croissantes de33rb1cc1. a. Courbes de thermophorèse où la fluorescence normalisée sur trois mesures est représentée en fonction du temps de mesure en secondes. Les données sont enregistrées à 25°C pour des puissances d’excitation et de laser-IR respectives de 30% et 20%. Le moment de thermophorèse pris en compte pour le tracé de la courbe de liaison sigmoïdale est représenté par les barres bleue et rose. Les courbes grisées correspondent aux mesures non significatives qui n’ont pas été prises en compte pour l’expérience. b. Sigmoïde de liaison permettant la détermination du Kd. Les barres d’erreur sur les trois mesures sont représentées pour chaque point (χ² = 7,27 ; SER = 2,08). La concentration de 33rb1cc1 varie de 0,76 µM à 25 µM pour une concentration constante d’ERRα marqué de 25 nM.
a.
125
3. Tests de cristallisation
Les premiers tests de cristallisation des complexes ERRα/ADN/peptide ont été réalisés en utilisant les screens de cristallisation disponibles sur la plateforme de biologie et de génomique structurales de l’IGBMC. Des cristaux sont apparus en moins de 24 heures avec les trois types d’oligonucléotides dans les mêmes conditions de cristallisation (tableau 14). Leurs formes étaient plutôt allongées avec l’oligonucléotide 21trα-TT et hexagonales avec les 26trα-21trα-TT et 29trα-AA (tableau 14).
Afin de ne pas perturber le réseau cristallin en plongeant les cristaux dans une solution de cryoprotection, une déshydratation a été préférée, en augmentant progressivement la concentration de précipitant du réservoir (52%, 54%, 56%, 58% et 60% v/v de PEG400, avec une concentration constante de 0,1 M C2H3NaO2 pH 4,5 et de 0,1 M LiSO4.). Cependant, dès le premier échange de réservoir, les cristaux se sont dissous.
Cristaux Conditions de cristallisation
et screens Oligonucléotide Peptide
0,1 M C2H3NaO2 pH 4,5 0,1 M LiSO4 50% PEG400 JCSG+, A1 21trα-TT PF25 0,1 M C2H3NaO2 pH 4,5 0,1 M LiSO4 50% PEG400 JCSG+, A1 26trα-TT PF25 0,1 M C2H3NaO2 pH 4,5 0,1 M LiSO4 50% PEG400 JCSG+, A1 29trα-AA PF25
Tableau 14 : Cristaux obtenus lorsque les complexes ERRα/21trα-TT/PF25, ERRα/26trα-TT/PF25 et ERRα/29trα-AA/PF25 ont été mis à cristalliser
126 Seul un cristal de ERR, avec l’oligonucléotide 29trα-AA et le peptide PF26, a pu être reproduit par la suite (tableau 15) dans les mêmes conditions de cristallisation. Il a été directement récolté de sa goutte et congelé. Cependant, ce cristal, analysé par diffraction aux rayons-X au synchrotron, s’est avéré être un cristal de sel.