Étude structurale de complexes DBD/ADN

2.1.Caractérisations préalables de complexes DBD/ADN

2.1.1. Stabilité en fonction de la concentration saline

La stabilité de complexes protéiques ou protéo-nucléotidiques n’est optimale que dans une certaine gamme de concentrations salines. Par exemple, une concentration trop importante en sel peut déstabiliser l’interaction entre les deux partenaires et conduire à leur dissociation. Ceci est aussi valable pour les concentrations trop faibles en sel qui induisent une précipitation du complexe. Cette information est importante pour concevoir les essais de cristallisation et pour prévoir et comprendre le comportement du complexe selon la concentration en sel dans la solution.

Ainsi, pour suivre l’évolution de la stabilité du complexe DBD/ADN, un gradient croissant de concentration en NaCl a été imposé à un complexe DBD/ADN préformé et son comportement a été suivi par migration sur gel d’électrophorèse PAGE-8% en conditions natives. Les concentrations de NaCl utilisées sont de 70 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM et 500 mM. Le DBD seul (sans ADN) est utilisé comme contrôle de cette expérience. Du fait de son pI théorique (9,64), quasiment égal au pH du gel (10,3), il ne pénètre pas dans le gel, comme l’atteste l’absence de bande sur la figure 51. En présence d’ADN en revanche, le complexe migre dans le gel. Aucune dissociation n’est visible jusqu’à 400 mM. Le complexe présente cependant des signes d’instabilité à partir de 500 mM (figure 51).

Figure 51 : Migration sur gel en conditions natives d’un complexe DBD/ADN en fonction d’un gradient de concentration de NaCl

1. DBD seul, 2.70 mM, 3. 100 mM, 4. 200 mM, 5. 300 mM, 6. 400 mM, 7. 500 mM.

105 2.1.2. Étude de la stabilité du DBD par fluorimétrie différentielle (Thermofluor) Pour suivre la stabilité du DBD au sein des complexes, des expériences de Thermofluor ont été réalisées afin de déterminer la température de demi-dénaturation Tm du DBD seul et en complexe avec l’oligonucléotide 21trα (figure 52). L’évolution de la fluorescence est présentée en fonction d’un gradient de température en °C. La solution utilisée présente la même composition que celle utilisée pour l’étape de chromatographie d’exclusion stérique.

Les deux courbes présentes la même allure, avec cependant une fluorescence plus importante dans le cas du DBD seul. Ceci s’explique par une exposition plus importante de ses parties hydrophobes où se lie le fluorophore SYPRO. En revanche, un Tm de 57,5°C est déterminé pour le DBD seul et le DBD complexé à l’oligonucléotide 21trα. La stabilité du DBD n’est donc pas améliorée par sa liaison à l’ADN.

2.1.3. Complexes utilisés pour les tests de cristallisation

Le DBD issu de la purification est utilisé pour la formation des complexes DBD/ADN utilisés en cristallisation. Les différents oligonucléotides utilisés sont présentés dans le tableau 11. Après formation des complexes, leur homogénéité est vérifiée sur gel d’électrophorèse PAGE-8% en conditions natives. La figure 53 montre la migration du DBD seul en tant que contrôle, et des complexes qu’il forme avec les oligonucléotides 21trα-TT, 26trα-TT, 29trα-AA. Ces complexes se présentent tous sous forme d’une unique bande sur le gel, témoignant de la présence d’une conformation unique.

Pour confirmer cette observation, des mesures de DLS sont systématiquement réalisées en parallèle des essais de cristallisation et renseignent sur la présence éventuelle d’espèces minoritaires, qui ne sont pas toujours visibles sur un gel. Les mesures présentées sur la figure 54 ont été réalisées sur le DBD seul et sur les complexes DBD/21trα-TT, DBD/26trα-TT et DBD/29trα-AA. Les résultats obtenus pour le DBD seul témoignent d’un comportement instable de ce dernier, avec un profil multimodal (plusieurs espèces en solution de taille et masse différentes) et des paramètres de rayon hydrodynamique largement surestimés, ne permettant pas le tracé d’un diagramme de régularisation (correspondant à la représentation du pourcentage de masse en fonction du rayon des particules en nm). Les résultats concernant les complexes DBD/21trα-TT, DBD/26trα-TT et DBD/29trα-AA attestent quant à eux d’une stabilité accrue du DBD,

Figure 52 : Courbes de dénaturation du DBD et du complexe DBD/21trα

La dénaturation du DBD (vert) est comparée à celle du complexe DBD/21trα (rouge). La stabilité du DBD est inchangée en présence d’ADN. La fluorescence est représentée en fonction de la température allant de 20°C à 95°C.

106 puisque ces complexes présentent respectivement un rayon hydrodynamique de 3,0 nm, 2,9 nm et 3,0 nm, une masse moléculaire relative de 44 kDa, 43 kDa et 46 kDa et un pourcentage de polydispersité de 14,4%, 7,5% et 12,0%. La présence d’ADN en complexe avec le DBD semble donc permettre à ce dernier d’être fortement stabilisé.

Température (°C) Rayon (nm) %Pd Mw-R (kDa)

DBD/21trα-TT 25,0 3,0 14,4% 44

DBD/26trα-TT 25,0 2,9 7,5% 43

DBD/29trα-AA 25,0 3,0 12,0% 46

Figure 53 : Migration sur gel PAGE-8% des complexes DBD/ADN en conditions natives

1. DBD seul, 2. DBD/21trα-TT, 3. DBD/26trα-TT, 4. DBD/29trα-AA. 3µg de protéines sont déposés dans chacun

des puits.

Figure 54 : Mesures de DLS réalisées sur les complexes DBD/21trα-TT, DBD/26trα-TT et DBD/29trα-AA

Sur les diagrammes, le pourcentage de masse est représenté en fonction du rayon des particules en nanomètre (nm) (haut). Les paramètres caractérisant les particules sont résumés dans le tableau (bas).

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2.2.Tests de cristallisation

Considérant leur faible polydispersité mesurée par DLS, les complexes DBD/ADN ont été utilisés pour mener des tests de cristallisation. Ces tests ont été réalisés sur différents complexes en utilisant les screens de cristallisation disponibles sur la plateforme de biologie et de génomique structurales de l’IGBMC. Des cristaux de complexe DBD/26trα-TT et DBD/29trα-AA sont apparus après dix jours d’incubation dans différentes conditions. Quelques exemples de cristaux sont présentés dans le tableau 12. Généralement, les cristaux s’organisaient sous forme d’amas et présentaient des formes allongées d’aiguilles avec une très fine épaisseur d’une dizaine de micromètres, rendant leur récolte difficile. Ces cristaux ont été congelés en utilisant des solutions cryoprotectantes de même composition que leurs conditions de cristallisation respectives supplémentées de 35% v/v final de PEG 3350. L’analyse de ces cristaux aux rayons-X n’a cependant pas permis d’obtenir une diffraction allant au-delà d’une dizaine d’angströms de résolution, mais a confirmé leur contenu protéique. Les meilleurs clichés de diffraction, observés avec l’oligonucléotide 29trα-AA, permettent notamment de conclure formellement qu’il s’agit de cristaux de protéine et non de sel ou d’ADN (figure 55).

Cristaux ^{Conditions de cristallisation et}

screens ^{Oligonucléotide}

0,1 M MES pH 6,0 0,1 M NH4Cl 0,1 M MgCl2

25% PEG 3350

DBD RAR/RXR, condition A10

26trα-TT 0,1 M MES pH 6,0 0,2 M NH4Cl 0,1 M MgCl2 25% PEG 3350 DBD RAR/RXR, condition B10 26trα-TT 0,1 M MES pH 6,0 0,3 M NH4Cl 0,1 M MgCl2 25% PEG 3350 DBD RAR/RXR, condition C10 26trα-TT 0,2 M Mg(CH3CO2)2 20% PEG 3350

The PEGs, condition G1

29trα-AA

Tableau 12 : Exemple de cristaux du DBD en complexe avec les oligonucléotides 26trα-TT et 29trα-AA

Les tailles des cristaux en micomètres (µm), leurs conditions de cristallisation et les oligonucléotides utilisés sont précisés.

25x300µm 10x155µm 10x300µm 50x85µm 45x190µm _35x115µm 20x110µm 30x120µm 25x95µm 15x80µm

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