L’objectif principal de ce travail de recherche constitue à recréer, par génie tissulaire, un modèle de peau humaine, comprenant un épiderme stratifié et un derme, avec une pseudo-vascularisation, une immunocompétence apportée par des cellules dendritiques, et une innervation sensorielle nociceptive. Ce modèle servira d’outil d’analyse à l’interaction entre système immunitaire et système nerveux cutané, à travers l’exemple des DCs et neurones nociceptifs.
5-1. Action de la substance P et du CGRP sur les cellules
dendritiques humaines
En parallèle de la mise au point du modèle de peau, l’impact direct de la SP et du CGRP sur les DCs humaines sera évalué. Nous observerons la capacité des DCs à s’activer dans une monoculture in vitro et à migrer hors d’un explant de peau ex vivo, sous influence des neuropeptides.
5-1-1. Modulation de la maturation des DCs par les neuropeptides
L’utilisation de DCs différenciées in vitro par du GM-CSF et de l’IL-4 à partir de monocytes sanguins humains (MonoDCs) servira à l’étude de l’action de neuropeptides sur les DCs cutanées. Ces MonoDCs diffèrent de celles se différenciant naturellement dans la peau normale humaine en contexte pro-inflammatoire (Introduction, partie 2-4-3) par l’expression de CD1a et une faible expression de CD14. L’avantage des MonoDCs générées in vitro est d’avoir un phénotype immature après différenciation. Ces cellules sont ainsi capables induire des réponses TH1, TH2 ou TH17 in vitro en fonction des conditions de stimulation [559-561]. Il faut toutefois noter que la différenciation des monocytes sanguins en MonoDCs génère une population homogène ne pouvant pas refléter toutes les réponses de toutes les différentes populations de DCs cutanées en cas de stimulation [562]. Même si les MonoDCs restent un bon modèle in vitro de maturation et d’orientation de la réponse des TH, leurs fonctions ne doivent donc pas être extrapolées à l’ensemble des réactions potentielles induites par les cDCs du derme et les LCs [561, 563].
La première étape dans l’utilisation des MonoDCs comme modèle sera de vérifier leurs expressions des récepteurs NK1R et CLR/RAMP1. La maturation des MonoDCs se fera avec du LPS et sera modulée par
la SP et le CGRP. Leurs phénotypes après stimulation seront analysés par cytométrie en flux pour discerner les MonoDCs matures (HLA-DRhigh, CD86+, CD83+) des immatures (HLA-DR+, CD86-, CD83-).
5-1-2. Modulation de la migration des DCs par les neuropeptides
La migration des DCs hors de leurs tissus pour la présentation de l’antigène est une caractéristique que les neuropeptides sont susceptibles de moduler. Un explant de peau normale humaine correspondant à l’épiderme et au derme supérieur sera placé sur un filtre en nylon à l’interface avec entre l’air et le milieu de culture. La mise en culture d’un explant place la peau dans un contexte pro-inflammatoire et une partie des DCs cutanées vont migrer hors du tissu et se retrouver dans le milieu de culture. Par analyse de cytométrie en flux nous distinguerons 3 populations de DCs migrantes, les LCs (CD207+), les DCs CD1a+ et les DCs CD14+.
5-2. Caractérisation physiologique et fonctionnel du modèle de
peau immunocompétent et innervé par des neurones murins
En monoculture, les MonoDCs ne se maintiennent pas leur état immature sur de longues périodes après leur différenciation. Le simple ajout de ce type cellulaire dans un modèle de peau innervé, déjà caractérisé [6], représente une première problématique.5-2-1. L’intégration des MonoDCs immatures dans un derme humain reconstruit
Le modèle de derme simple a été choisi pour évaluer l’intégration des MonoDCs et la compatibilité des cellules avec le support de culture et les fibroblastes et cellules endothéliales provenant d’autre donneurs. Les cellules endothéliales, à cause des facteurs chemioatractants, comme le CCL19 et le CCL21, qu’ils peuvent sécréter, représente un atout pour la stabilité des MonoDCs dans le modèle. Nous évaluerons, par observation en immunofluorescence, la quantité optimale de MonoDCs à ensemencer pour recréer une immunocompétence comparable à la peau normale humaine.
5-2-2. Caractérisation du phénotype des MonoDCs dans le modèle de peau et de
leur capacité à migrer en cas d’activation
Une fois les MonoDCs intégrés au modèle de peau (derme, vascularisation et épiderme), nous chercherons à évaluer leurs phénotypes à la fin de la culture, nécessaire à la formation de l’épiderme. Nous chercherons à observer leurs états de maturation, suite ce long temps de culture et également leurs capacités à répondre à des activations au LPS. Cette réponse pourrait se traduire par une migration des MonoDCs hors du modèle et par l’expression de CD86 par les cellules restées hors du modèle.
5-2-3. Utilisation du modèle de peau innervé, vascularisé et immunocompétent
comme outils de détections de molécules sensibilisatrices.
Assembler neurones issus d’embryons de souris et MonoDCs dans un modèle de peau vascularisé, avec un épiderme stratifié, nous permet d’étudier l’interaction entre le système nerveux et le système immunitaire cutané. Nous avons choisi le LPS comme activateur stricte des MonoDCs et la capsaïcine, comme activateur stricte des neurones murins. Ces deux contrôles vont nous permettre d’évaluer la réponse de notre modèle face à la stimulation de molécules sensibilisatrice. Ces molécules sont : le Dinitrochlorobenzene (DNCB), Acide-DL-Tartarique (TA), le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) et l’Ethylène glycol diméthylacrylate (EG), recensés du sensibilisateur le plus extrême au plus faible par le test LLNA. Nous cherchons comparer la classification d’un modèle de sensibilisation in vivo face aux réponses de notre modèle. La réponse du modèle s’observera par quantification de cytokines présents dans les surnageant de culture et pas observation de la morphologie des tissus par immunofluorescence.
Pour compléter l’étude, nous choisissons d’utiliser, 4 constructions :
- Modèle de peau avec un derme vascularisé et un épiderme stratifié : F + E + K - Modèle de peau immunocompétente : F + E + K + MonoDCs
- Modèle de peau avec une innervation d’origine murine : F + E + K + DRGs
- Modèle de peau complète, vascularisée, immunocompétente avec innervation d’origine murine : F + E + K + DRGs + MonoDCs
Ces constructions vont permettre, la fois d’évaluer la pertinence de nos contrôles comme sensibilisateurs stricts d’un système, mais également de préciser le mode d’actions des sensibilisateurs.
5-3. Développement d’un modèle de peau innervée par des
neurones sensoriels humain et des cellules de Schwann
dérivés d’iPSCs
L’objectif final ce projet de recherche est d’allier les résultats précédemment obtenus pour orienter le modèle vers une construction comprenant uniquement des cellules d’origine humaine. Les neurones humains proviennent de la différenciation d’iPSCs et se doivent de respecter les mêmes caractéristiques morphologiques que fonctionnelles que les neurones murins.
Nous évaluerons le phénotype des neurones humain en culture 2D et intégrés au modèle de peau, notamment leurs expressions des TRPs et des neuropeptides. Les neurones murins et humain seront stimulés par des agonistes de TRPV1 et quantifier leurs capacités à sécréter de la SP et du CGRP.
La capacité d’innerver un tissu faisant partie intégrante du bon fonctionnement d’un neurone sensoriel, les neurones humains doivent innerver le modèle de peau au complet, c’est-à-dire le derme jusqu’à l’épiderme, comme les DRGs.
Ces résultats ont donné lieu à la soumission d’une publication, actuellement en cours de révision, dans le journal Acta Biomaterialia.
5-4. Transfert technologique
Cette thèse, servant de support au travail de recherche, a été réalisée en cotutelle entre l’Université de Strasbourg, en France, et l’Université Laval, à Québec, et s’est concrétisée par la collaboration en le Dr. Vincent Flacher, à l’UPR3572, au CNRS de Strasbourg et le Dr. Berthod au Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale (LOEX ; Université Laval, Québec).
Le LOEX possède et développe la peau reconstruire par génie tissulaire et innervée par des neurones murins depuis 2003 [5]. L’UPR3572 maîtrise l’extraction et la différenciation des myocytes sanguins humain en MonoDCs, ainsi que leur caractérisation phénotypique par cytométrie en flux. Au travers de la cotutelle, mon rôle est de faire sorte en ces deux techniques soient implantées de façon diable dans les deux laboratoires.
La concrétisation de cet objectif ne rendra le modèle que plus robuste, puisque sa construction sera reproductible dans deux laboratoires différents.