Analyses

1.6.1 Phénotypage des monocytes, MonoDCs différenciés et activés et des DCs

de la peau par cytométrie en flux

Marquage par immunofluorescence directe des cellules pour l’analyse par cytométrie en flux.

Les monocytes extrais sont phénotypées par le marquage HLA-DR / CD14 / CD3, avec le 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) comme marqueur de mortalité cellulaire. Les anticorps, directement couplés aux fluorochromes (Matériel et méthode, Parti 1, Tableau 3), sont incubés avec les cellules 20 minutes à 4°C et dilués en quantité optimale en solution PBS+2%SVF+5mM EDTA (SE). Après lavage, les culots de cellules sont repris en SE contenant 1/100e de la solution stock de 7-AAD puis analysées au cytomètre en flux.

Les MonoDCs différenciées sont phénotypées par le marquage HLA-DR / CD14 / CD86 / CD2019 / CD1a, et les MonoDCs activées pendant 24 sont phénotypés par le marquage HLA-DR / CD83 / CD86 / CD2019 / CD1a, tous deux avec le Fixable Viability Dye (FVD) eFluor™ 450 ou 780 comme marqueur de mortalité cellulaire. Les cellules sont lavées en PBS et incubées 30 minutes à 4°C avec le marquer de mort. Après lavage en SE, les anticorps, directement couplés aux fluorochromes (Matériel et méthode, Parti 1, Tableau 3), sont dilués en quantité optimale en solution SE et incubés avec les cellules 20 minutes à 4°C. Après un lavage en SE, les cellules sont analysées au cytomètre en flux.

Les cellules dendritiques sortantes de la peau, par de la technique dite du « Crawl-Out », sont phénotypées par HLA-DR / CD207 (marqueur intracellulaire) / CD209 / CD14 / CD86 avec le FVD eFluor™ 450 ou 780 comme marqueur de mortalité cellulaire. Les cellules sont lavées en PBS et incubées 30 minutes à 4°C avec le marquer de mort. Après lavage en SE, les anticorps pour le marquage extracellulaire (HLA-DR, CD209, CD14 et CD86), directement couplés aux fluorochromes (Matériel et méthode, Parti 1, Tableau 3), sont dilués en quantité optimale en solution SE et incubés avec les cellules 20 minutes à 4°C. Les cellules sont perméabilisées et fixées en suivant le protocole du kit de Fixation/Perméabilisation BD Cytofix/Cytoperm™. Les anticorps pour le marquage extracellulaire (ici, uniquement CD207), directement couplés aux fluorochromes (Matériel et méthode, Parti 1, Tableau 3), sont dilués en quantité optimale dans le tampon BD Perm/Wash™ et incubés avec les cellules 20 minutes à 4°C. Après lavage en solution SE, les cellules sont analysées par cytométrie en flux

Protocole d’analyse des populations cellulaires acquises par cytométrie en flux

Les données sont analysées pas le logiciel FlowJo®, dans sa version 7.6.5 et consiste en l’isolation numérique de populations cellulaires par l’intermédiaire de nuages de points (Gating strategy). Dans tous les cas, les cellules sont sélectionnées suivant leurs tailles et leurs granulosités (FSC/SSC) et seules les cellules vivantes sont prises en compte dans l’analyse final (négatives aux marqueurs 7-AAD ou FVD).

Le phénotypage des monocytes permets de conserver et utiliser uniquement les extractions ayant permises d’obtenir plus de 80% de monocytes (CD14+), avec un minimum de contaminant lymphocytaire (CD3+) (Figure 23-A). Après différenciation en MonoDCs, le phénotypages des cellules permet d’éliminer les extractions où les monocytes ne peuvent pas se différencier (CD209+ et CD1a+) à hauteur de 80%, avec moins de 10% de cellules de MonoDCs spontanément matures (CD86+) (Figure 28-B).

Figure 23 : Analyse de la purification et de la différenciation des monocytes en MonoDCs, puis analyse du phénotype mature des MonoDCs

Enfin, le phénotypage après activation, sur la base des MonoDCs exprimant toujours CD14a, permets de quantifier le pourcentage de cellules devenues matures en fonction de nos conditions de stimulation (Figure 28-C).

Par la technique dite du « Crawl-Out », une partie des DCs matures de la peau se retrouvent dans le milieu de culture, après 4 jours d’incubation (Figure 24-A). Le phénotypage des cellules obtenues, toujours en les discriminant suivant leur taille, leur granulosité (FSC/SSC) et en analysant uniquement les cellules vivantes (négatives au FVD), nous discriminons 3 types de DCs différents, les LCs, les DCs CD14+ _{et les DCs CD1a}+_.

Figure 24 : Analyse des populations de DCs obtenus par la technique du « Crawl-Out » pour discriminer les LCs, les DCs CD14+ _{et les DCs CD1a}+

Les LCs sont observé par leur expression de HLA-DR et de CD207. Les cellules exprimant HLA-DR mais n’exprimant pas CD207 sont sélectionnées pour observer leur expression de CD14 et discriminer les DCs CD14+_{, exprimant faiblement CD209 et les DCs CD1a}+_{, exprimant CD209 (Figure 24B).}

1.6.2 Quantification des cytokines par du milieu de culture pas technique ELISA

Kits ELISA utilisés :

- Quantification IL-12p70 : Human IL-12 (p70) ELISA Set, BD, Catalog No.555183 - Quantification TNF-α : Human TNF ELISA Set, BD, Catalog No.555212

Le protocole de réalisation des quantifications par technique ELISA provient du fournisseur des kits, BD Bioscience.

1.6.3 Protocole de marquages par immunofluorescence indirecte

Fixation et conservation des échantillons

Après la culture, les éponges et leur ancrage en papier sont fixés en Paraformaldéhyde (PFA) 4%, 20 minutes à température ambiante ou 45 minutes à 4°C. Après rinçage en PBS 1X, les échantillons sont partiellement déshydratés en Sucrose 30% masse/volume dans du PBS 1X. L’incubation minimum est sur toute la nuit à 4°C, les échantillons peuvent être conservés dans le sucrose ou dans du PBS1X jusqu’à utilisation.

Les éponges utilisées pour réaliser des coupes transversales sont débarrassées de leur encrage en papier, coupées en deux par leur milieu, et incluses dans le composant OCT (Optimal cutting temperature

compound) et conservées à -80°C. Les coupes transversales de 5µm à 30µm d’épaisseur, sont réalisées sur

un cryostat Leica CM3050 S, de façon à ce que l’épiderme et le derme soient coupés en même temps par la lame.

Technique de marquage par immunofluorescence indirecte

Les éponges et coupes transversales sont perméabilisées et saturées entre 1 et 4 heures (1 heure pour les coupes et jusqu’à 4h pour les éponges complètes) avec une solution de 2% d’albumine de sérum bovin (bovine serum albumin, BSA), supplémenté avec 0,1% de Triton100X dans du PBS1X, puis lavées en PBS 1X. Les anticorps primaires, à la dilution optimale (autour de 100 et 200ng/mL) dans du PBS1X+BSA2% sont incubés toute la nuit à 4°C. Après une série de lavages en PBS, les anticorps secondaires, à la dilution optimale (entre 0,5 et 2µg/mL, suivant les recommandations du fournisseur) dans du PBS1X+BSA2%, sont incubés sur les échantillons entre 1 et 4 heures (entre 1 et 2 heures pour les coupes et jusqu’à 4h pour les éponges complètes) à température ambiante, à l’abri de la lumière.

Un marquage de l’ADN (des noyaux des cellules, dans ce qui nous intéresse) au 4',6-Diamidino-2- phenylindole (DAPI) peut être fait en même temps que l’anticorps secondaire à 0,5µg/mL ou 20 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière à 5µg/mL, dans du PBS.

Après de multiples lavages en PBS, les échantillons sont inclus dans du milieu de montage Fluoromount-G®. Les éponges complètes marquées par immunofluorescences indirectes sont incluses entre deux lamelles de verres, pour permettre une orientation adéquate au moment de l’observation au microscope. Une incubation de 24 à 48 heures, à température ambiante et à l’abri de la lumière, est nécessaire pour une polymérisation complète du milieu de montage.

Observation des échantillons marqués, acquisition et analyse des images

Les échantillons ont été observé au microscope Confocal LSM700 de chez Zeiss et les images ont été acquises par le logiciel propriétaire logiciel ZEN 2010. Les images brutes à l’extension .zvi ou .lsm ont été analysées par le logiciel libre de droit ImageJ dans sa version ImageJ-2 Fiji.

1.6.4 Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été faites en utilisant une analyse de la variance à un facteur (one-way ANOVA), corrigé par un test du comparaison multiple (test post-hoc) Bonferroni avec un risque d’erreur α=0,05. Les résultats de comparaisons sont considérés comme significatifs quand le calcul de la p-valeur observée est inférieure au risque α. Les résulats sont exprimés en moyennes ± leur écart-type centré sur la moyenne (standard error of the mean, SEM).